荧光定量PCR实验指南.doc

荧光定量PCR实验指南（一）

一、????????

基本步骤：

1、???????????目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；

2、???????????引物、探针的设计；

3、???????????引物探针的合成；

4、???????????反应体系的配制；

5、???????????反应条件的设定；

6、???????????反应体系和条件的优化；

7、???????????荧光曲线和数据分析；

8、???????????标准品的制备；

二、????????技术关键：

1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；

从网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“openentrezsequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“addall”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimummathpercentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemblecontig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimummathpercentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。

2、引物和探针设计

2.1引物设计??

细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：

????????????序列选取应在基因的保守区段；

????????????扩增片段长度根据技术的不同有所分别：

sybrgreenI技术对片段长度没有特殊要求；

Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；

????????????避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；

????????????避免引物自身形成环状发卡结构；

????????????典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；

????????????引物之间的TM相差避免超过2℃；

????????????引物的3’端避免使用碱基A；

????????????引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。

????????????为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

2.2?Taqman探针设计一般设计原则：

????????????探针位置尽可能地靠近上游引物；

????????????探针长度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。

????????????探针的5’端应避免使用碱基G。

????????????整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。

????????????为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。(/BLAST)

2.3?Taqman?MGB探针设计介绍

MGB探针