生物菌种与扩大培养.pptVIP

*生活细胞的冻结细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键悬浮细胞的冻结首先是细胞外冻结。细胞外水的冻结温度为-5～-15℃细胞内游离水在-25℃冻结，-30℃时，细胞几乎没有非冻结状态的自由水存在。Luyet的二步冻结法先对细胞慢速降温（1℃/min）到-30℃，造成细胞外冻结，细胞内脱水。然后提高降温速度。第63页,共93页，2024年2月25日，星期天*细胞的超低温冻结即便在-70℃，细胞内某些酶类仍具备一定活性，使细胞进行简单、缓慢的代谢，导致细胞出现“衰老”现象。温度波动也会产生物理和化学反应，受溶液冻结、融化以及渗透压力变化的影响，细胞受到不同程度的损伤。这种低温损伤主要发生在0∽-60℃范围内。Meryman曾引证在-130℃无生化活性产生，因此推断，在-130℃或更低，生物代谢是停顿的。能够经受超低温冻结以及其后融化的生物，在超低温条件下，可实现无定限地保持原有性状存活。为实现细胞的超低温保存，一般均需在溶液中加入一定种类的低温保护剂并针对不同的细胞，设计特定的降温和复温程序。没有这些特定的条件，细胞在降温复温过程中必然会遭到低温损伤而死亡。第64页,共93页，2024年2月25日，星期天*冷冻对微生物细胞的致死损伤细胞的超低温冻存由三个技术步骤组成：细胞预冻；细胞在超低温下的长期储存；细胞冻融。致死损伤发生在预冻和冻融阶段。细胞的损伤是全方位的，包括：膜系统的完整性受损（膜的融合和膜的相变）；或亚细胞结构受破坏；或代谢酶失活（不利物质大量积累或必需营养物质大量分解）第65页,共93页，2024年2月25日，星期天*冷冻导致细胞损伤的机理1972年，Mazur等首先提出冷冻损伤的两因素假说。机械损伤：细胞内外冰晶生长而产生的机械力量造成膜结构损伤，从而影响细胞的生理、代谢功能的正常发挥。这是过快冷却所产生的，冷却速率越快，损伤越大。溶质损伤：水的冻结使细胞间隙内的液体逐渐浓缩，电解质浓度显著增加，胞内pH值和离子强度改变，潜在的不利化学反应发生率提高，如蛋白质变性，膜脂蛋白复合体的破坏；细胞膜脱水收缩达到临界最小体积时，会使细胞膜的渗透率产生不可逆的致命增加等。这是由于过慢冷却所产生，冷却速率越慢，细胞在高浓度溶液中暴露的时间越长，损伤越大。溶质损伤在预冻的某一温度范围内最为明显，这个温度范围在水的冰点和该溶液的全部固化温度之间，以较高速度越过这一温度范围，可以减弱溶质损伤。第66页,共93页，2024年2月25日，星期天*低温保护剂：

渗透型保护剂：

甘油、DMSO、乙二醇、乙酰胺、丙二醇等。

使胞内压接近胞外压，降低细胞脱水皱缩的程度和速度；

易进出细胞，复温时缓解渗透性肿胀引起的损伤。

非渗透型保护剂：

聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖、白蛋白等

使溶液呈过冷态，可在特定温度下降低溶质浓度；

使胞内水分提前部分渗出，缓解胞内冰晶的形成。第67页,共93页，2024年2月25日，星期天*1.4.2国内外主要菌种保藏机构

菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种、菌株基础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使用的目的。

中国：中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM）；

美国：美国典型菌种保藏中心（ATCC）；

英国：国家典型菌种保藏所（NCTC）；

法国：里昂巴斯德研究所（IPL）；

日本：大阪发酵研究所（IFO）；

德国：科赫研究所（RKI）；

荷兰：真菌中心收藏所。第68页,共93页，2024年2月25日，星期天*第三节工业微生物菌种的选育一、工业微生物选育的目的：1、选育的目的改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。微生物所发酵得到的产品，除了初级代谢产品如氨基酸和维生素外还有许多次级代谢产物。我们想要得到产物的两个成功要素在于（1）产生菌的选择；（2）采用什么样的选育方案（包括检测性能系统），还有不管寻找哪一类生物活性物质，在选择选育方法时必须要考虑两个要点即---选择性和灵敏性。菌种选育包括自然选育和诱变选育。第69页,共93页，2024年2月25日，星期天*2、选择性分离方法大致分为五个步骤：

（1）含微生物材料的选择；

（2）材料的预处理；

（3）所需菌种的分离；

（4）培养；

（5）菌落的选择和纯化。第70页,共93页，2024年2月25日，星期天*3、筛选时宜考虑的一些重要指标：

（1）菌的营养特征，在发酵过程中，常会遇到要求采用廉价的培养基or使用来源丰富的原料；

（2）菌的生长温度应选择温度较高的菌种这可以大大降低大规模发酵的冷却成本；