植物遗传转化技术（下）.pptxVIP

转基因植株的再生植株再生是基因转化的关键步骤，直接决定能否获得转基因植物。转基因植株的再生分为两种形式：愈伤组织再生、直接再生。转基因植株的再生与一般组织培养的再生方式相同；二者的区别：转基因植株的再生受到外源基因、载体系统、受体系统、抗生素、转化过程等的影响。

标记基因的检测转基因植株的检测图片来源于网络，仅供教学使用，版权归作者所有带有目的基因的嵌合基因被转入到某种受体系统以后，必须对转基因植物材料进行分析与鉴定，以确定外源基因是否在转基因植物中正常表达。转基因植物的检测方法：对标记基因进行检测；对外援目的基因进行检测。

标记基因的检测转基因植株的检测标记基因是用来区分目的基因转化细胞和非转化细胞的一类特殊基因。按功能分为选择标记基因和报道（告）基因。选择标记基因包括抗生素抗性基因和抗除草剂基因。如：kan、hyg、neo、amp、npt等。图片来源于网络，仅供教学使用，版权归作者所有

标记基因的检测转基因植株的检测报告基因指其编码产物能够被快速的测定；常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。如gus、luc、gfp等。图片来源于网络，仅供教学使用，版权归作者所有

转基因植株的检测方法目的基因整合水平的鉴定：PCR检测、Southern杂交等。目的基因转录水平的检测：Northern杂交、RT-PCR。外源基因表达蛋白的检测：ELISA检测、Western杂交。其它方法：基因芯片技术、试纸条技术、原位杂交技术等。

PCR检测对目的片段的快速扩增，实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应。经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性。根据外源基因序列设计出一对引物，通过PCR反应便可特异性地扩增出转化植株基因组内外源基因的片段，而非转化植株不被扩增，从而筛选出可能被转化的植株。

PCR检测PCR检测优点：所需的DNA用量少，纯度要求也不高，不需用同位素，实验安全，操作简单，检测灵敏，效率高，成本低。引物设计不合理，靶序列或扩增产物的交叉污染，外源DNA插入后的重排、变异等因素都会造成检测的误差。PCR检测缺点：易出现假性结果。

Southern杂交转基因植株再生及其检测利用经过标记的DNA、RNA探针与靶DNA进行特异性杂交；分析外源基因在植物染色体上的整合情况以及外源基因在转基因后代的稳定性问题。已广泛应用于水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、桃等各类作物转基因植株的检测。

Southern杂交转基因植株再生及其检测优点：不受操作过程中的DNA污染影响，准确度高，特异性强。缺点：程序复杂，成本高，对实验技术条件要求较高。

Northern研究转基因植株中外源基因表达及调控的重要手段。现已用于马铃薯、水稻、烟草的目的基因表达进行鉴定。分三部分：植物细胞总RNA的提取、探针的制备、印迹及杂交。优点：Northern杂交比Southern杂交更接近于目的性状的表现，更有现实意义。缺点：灵敏度有限，对细胞中低丰度的mRNA检出率较低。

RT-PCR转基因植株再生及其检测在反转录酶作用下，以待检植株的mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板扩增出特异的DNA。RT-PCR可在mRNA水平上检测目的基因是否表达。图片来源于网络，仅供教学使用，版权归作者所有优点：十分灵敏，能够检测出低丰度的mRNA。缺点：检测过程中必须注意RNA的降解和DNA的污染，还要设置严格的对照来防止假性结果的出现。

转基因植株外源基因表达产物：一般为蛋白；外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理；外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能才是植物基因转化的最终目的。经典方法：ELISA、Western。图片来源于网络，仅供教学使用，版权归作者所有

酶联免疫吸附法（ELISA）转基因植株再生及其检测基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记；把抗原抗体反应的高度专一性、敏感性与酶的高效催化特性有机结合，从而达到定性或定量测定的目的。图片来源于网络，仅供教学使用，版权归作者所有此方法已在棉花、辣椒、水稻、烟草、番茄等多种转化植株的检测中应用。

酶联免疫吸附法（ELISA）转基因植株再生及其检测图片来源于网络，仅供教学使用，版权归作者所有优点：便捷、灵敏、特异性好、试剂商业化程度高、成本低、适用范围广、试验结果易读等。缺点：易出现本底过高，缺乏标准化等问题。

Western杂交将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的蛋白质检测技术；据检出结果可知目的蛋白是否表达，浓度大小及大致的分子量。优点：能够直接表现出目的基因的导入对植株的影响，一定程度上反映了转基因的成败。缺点：操作烦琐，费用较高，不适合做批量检测。应用于