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CRISPR-Cas9Technique
IntroductionofCRISPR-Cas9technique
JenniferDoudna,right,saysthatsheandherlabmanager,KaihongZhou,are“twopeasinapod.”
Science.2013Feb15;339(6121):819-23.
张锋ZhangFeng1983年生于中国，幼年时随家庭移民到美国艾奥瓦州，在此长大。美国神经生物学家，现任麻省理工学院助理教授。2004年，在哈佛大学取得化学及物理学士。2009年，在斯坦福大学取得化学及生物工程博士。2013年，他的实验室发展出CRISPR/Cas系统，可以用来编辑DNA，敲除指定的基因。2014年，被《自然》杂志评选为2013年年度十大科学人物之一。
CRISPR——ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeatsCas——CRISPR-associatedProtospacer(DNA)PAM——ProtospacerAdjacentMotiff(DNA)spacer（RNA）CrRNA——CRISPRrelatedRNAtracrRNA——trans-activatingRNAsgRNA——singleguidedRNA
Cas9Science.2012,17;337(6096):816-21.
CollaborationwithOsamuNurekiandHiroshiNishimasuatUniversityofTokyorevealscrystalstructureofCas9incomplexwithguideRNAandtargetDNA.cell.Volume156,Issue5,p935–949,27February2014.Cas9HNHdomaincleavesthecomplementaryDNAstrandCas9RuvC-likedomaincleavesthenoncomplementaryDNAstrand
23ntSpCas9
SpCas9
PAMNNNThenoncomplementaryDNAstrandiscleavedatoneormoresiteswithinthreetoeightbasepairsupstreamofthePAM.Thenoncomplementarystrandisfirstcleavedendonucleolyticallyandsubsequentlytrimmedbya3′-5′exonucleaseactivity(?).5′5′3′3′efficientbutlessprecise
singlecas9cutTheDNAstrandthatiscomplementarytothetarget-bindingsequenceinthecrRNA(thecomplementarystrand)iscleavedatasitethreebasepairsupstreamofthePAM).PAMNNN
……moreprecisebutlessefficientdoublecas9s（D10A）cuts
CrRNAandtracrRNAsgRNA
Off-TargetPositiondependent:the8-14bponthe3′endoftheguidesequenceislesstolerantofmismatchesthanthe5′bases;Quantitydependent:ingeneral,morethanthreemismatchesarenottolerated;Guidesequencedependent:someguidesequencesarelesstolerantofmismatchesthanothers;Concentrationdependent:off-targetcleavageishighlysensitivetothetransfectedamounts,aswellasrelativeratiosofCas9andsgRNA.
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