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实验1细胞工程基础实验技术实验准备：

MS培养基母液配制

按配方表配制MS培养基母液：大量元素配20×，微量元素和其它成分配制成200×，母液贮存于2～4℃的冰箱中。

植物激素配制

BA和NAA配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。

实验目的

使学生了解培养基母液的配制方法和注意事项；掌握培养的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导实验准备培养基。

实验用品及溶液

实验按每4个学生一组，每组分发培养基母液及激素母液一套，50ml量筒、1000ml

有刻度烧杯、吸球、电炉各1个，5ml移液管9支，50ml三角瓶20个。公用设备：pH计，高压灭菌锅。

操作方法

实验按500ml容量一组配制培养基，保证下一次实验每一学生有5瓶培养基供接种用。

愈伤组织诱导培养基：MS＋BA2mgl-1+NAAmgl-1+Sucrose20g-1+Agar7g-1A．向容量瓶中顺序加入培养基母液：

大量元素25ml微量元素2.5ml铁盐2.5ml

其它成分各2.5mlBA和NAA各2.0ml

加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水，加入10g蔗糖后搅拌使其溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCl调整pH至5.8-6.0。

加入3.5g琼脂，将烧杯置于电炉上，搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水定容至终体积500ml，继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。用记号笔写上学号或姓名。

分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力1.1kg/cm2，灭菌时间20min.左右。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。

记载内容

培养基配制过程。灭菌方法

介绍不同类型灭菌设备的使用方法；采用高压蒸汽灭菌器对配置的培养基进行灭菌。

实验2无菌操作及愈伤组织诱导技术实验准备：

烟草无菌试管苗培养：将烟草种子用消毒液84＃消毒后，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干水分，接种在MS培养基上。种子苗具4-5叶时继代扩繁90盒，保证每学生1盒。

无菌培养皿每学生2套。

实验课开始前30min.将实验用具、培养基及无菌烟草苗同时用酒精用75%酒精擦洗后置于超净工作台，打开超净工作台风机和紫外灯。

实验目的

掌握无菌操作技术；基本掌握植物愈伤组织诱导培养技术和调控条件。

实验材料及设备

外植体材料：烟草无菌苗叶片；实验1配制的培养基。

设备及工具：超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等；75%酒精。

操作方法

在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作。

点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。

取一无菌培养皿，然后用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中，并用锋利解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片，然后将其接种于准备好的培养基上，一般每瓶接种4-5小片。

快速封好瓶口，用记号笔写上姓名和接种日期。

接种后的三角瓶置于24℃，条件下黑暗培养一周，然后在同样温度下有光照和全黑暗下培养直至愈伤组织形成。

注意外植体切割时，动作要快，否则会造成失水而影响生长。为防止操作时失水也可在培养皿中滴几滴无菌水，然后将无菌苗置于其中进行切割。

记载内容

培养基凝固状况；实验操作过程；叶片生长状况、接种外植体大小；每瓶接种数、接种总瓶数。

实验3器官发生与植株再生调控培养；愈伤组织增殖培养实验准备：

配制器官分化和愈伤组织诱导培养基。

培养基配方：分化培养基—MS基本培养基附加2.0mgl-1BA、和0.5mgl-1NAA。愈伤组织增殖培养基—MS基本培养基附加2.0mgl-1BA、和2.0mgl-1NAA。

实验目的

观察和分析不同光照条件形成的愈伤组织对器官分化的影响，观察和分析愈伤组织诱导和器官分化的激素使用差异；了解器官分化和植株再生的过程。掌握离体培养中的转接技术。

实验材料及设备

实验材料：实验2中诱导的愈伤组织实验设备和用具：同实验2。

操作方法

观察实验1愈伤组织诱导结果：统计愈伤组织诱导率；观察记载黑暗和光照条件下愈伤组织的差异，结合理论学习进行分析。

愈伤组织形成率＝愈伤组织数/接种外植体数

按照实验2相同的步骤，作好无菌操作准备。

将实验2中光照下诱导的愈伤组织，全部转入分化培养基上，黑暗诱导的愈伤组织一半转入分化培养基，所有转入分化培养基的愈伤组织均置于连续光照或16h/d光照，温度20－22℃条件下培养。

需要注意的是，愈伤组织的状态常常受许多因素的影响，如果转入分化培养后3

－4周仍然没有芽的形成，或愈伤组织状态没有明显变化，应及时调整培养基激