8基因表达-大肠杆菌基因工程.ppt

6目的基因在受体细胞中的表达;外源基因在原核细胞中的表达;二、常用原核表达载体

1、表达载体的一般组成：

(1)、启动子：强启动子；组织特异性；诱导性。

Lac启动子——来源于乳糖操纵子；Trp启动子——来源于色氨酸操纵子；Tac启动子；PL启动子。

（2）、转录终止子

（3）、核糖体结合位点

（4）、翻译起始序列、增强子、终止子;2、常用的原核表达载体

（1）、非融合型表达载体pKK223-3?

（2）、分泌型表达载体pinⅢ系统

以pBR322为基础构建的，含有大肠杆菌中最强的启动子之一，即Ipp(脂蛋白基因)启动子。

（3）、融合型表达载体pGEX系统

pGEX系统由Pharmacia公司构建，含有启动子tac及lac操纵基因、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因等。;;;;;三、外源蛋白表达部位

1、在细胞内直接表达重组蛋白：包涵体；

2、重组蛋白分泌到周质；

3、重组蛋白分泌到胞外培养基中；

4、以融合形式表达重组蛋白。

;四、提高克隆基因表达效率的途径

目前所知，有许多因素，诸如启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等，都会不同程度地影响到克隆基因的表达效率，而且大多数都是在转译水平上发生影响作用的，因而必须从分析这些因素入手，寻找提高克隆基因表达效率的有效途径。;1、启动子结构对表达效率的影响

启动子的强弱与它们的一致序列（即与-10和-35区序列）相似的程度成正比。研究表明，—35和—10区之间的距离也是一个重要因素。如果间隔为17个碱基对，启动子表现很强，如果大于17个碱基对，启动子表现较弱。

2、翻译起始序列对表达效率的影响

实验证明，连接在S—D序列后面的4个碱基成分的改变会对转译效率发生很大的影响。如果这个区域是由4个A(T)碱基组成，其转译作用最为有效；而当这个区域是由4个C碱基或4个G碱基组成，其转译效率只及最高转译效率的50％或25％。;3、启动子同克隆基因间距离对表达效率的影响

①翻译的起始点和S—D序列必须接近到一定程度；②翻译起始时mRNA的5’末端已折叠成特殊的二级结???，基因表达水平的改变是mRNA二级结构的反映。

4、转录终止区对克隆基因表达效率的影响

5、质粒拷贝数及稳定性对表达效率的影响;6、提高翻译水平常用的途径

调整S-D序列与AUG间的距离；

(2)用点突变的方法改变某些碱基；

(3)增加mRNA的稳定性。

7、减轻细胞的代谢负荷

8、提高表达蛋白的稳定性，防止其降解;五利用重组大肠杆菌生产人胰岛素;胰岛素的结构及其生物合成;人胰岛素的生产方法;人胰岛素的生产方法;人胰岛素的生产方法;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建;四、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策;一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征;大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征;二、外源基因在大肠杆菌中高效表达;核糖体结合位点;三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略;1、包涵体型异源蛋白的表达;包涵体的变性与复性操作;包涵体的复性与重折叠（refolding）：二硫键形成;2、分泌型异源蛋白的表达;分泌表达形式的优点：;分泌型异源蛋白的表达;分泌型异源蛋白表达系统的构建;3、融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;融合型异源蛋白的表达;二、基因表达的调控序列

1、启动子

???启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，

它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。

原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成：

（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游5—10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或—10区。

（2）—35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称—35区，一般由10个碱基组成。;2、S-D序列

???mRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存在，即S-

D序列，以及S-D序列与起始密码子AUG之间的距离。

1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，

它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10bp处