乙酰辅酶A含量检测试剂盒说明书.docxVIP

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紫外分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC0980

规格：25T/24S、50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶配内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称

25T

50T

保存条件

提取液一

液体30mL×1瓶

液体60mL×1瓶

2-8℃保存

提取液二

液体300μL×1支

液体600μL×1支

-20℃保存

试剂一

粉剂×1支/-20℃保存

粉剂×2支

-

试剂二

液体10μL×1支

液体10μL×2支

2-8℃保存

试剂三A

液体25mL×1瓶

液体50mL×1瓶

2-8℃保存

试剂三B

粉剂×1瓶

粉剂×2瓶

-20℃保存

试剂四

液体5mL×1瓶

液体5mL×1瓶

2-8℃保存

25T溶液的配制：

试剂一：临用前加入325μL试剂四，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

试剂二：临用前取1支先将液体甩离至管底，然后加入250μL试剂四，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

试剂三：临用取试剂三B加入24mL试剂三A，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

工作液：临用前将试剂一、二和三按照1:1:90的比例混合，根据样本量现配现用。

50T溶液的配制：

试剂一：临用前取加入325μL试剂四，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

试剂二：临用前取1支先将液体甩离至管底，然后加入250μL试剂四，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

试剂三：临用前取1瓶试剂三B加入24mL试剂三A，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

工作液：临用前将试剂一、二和三按照1:1:90的比例混合，根据样本量现配现用。

产品说明：

乙酰辅酶A广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于ATP合成。此外，乙酰辅酶A是合成脂肪酸、酮体、胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。

苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低

MalateDehydrogenaseCitrateSynthaseMalate+NAD+Oxaloacetate+NADH（340nm）

MalateDehydrogenase

CitrateSynthase

Oxaloacetate+AcetylCoenzymeACitrate+CoenzymeA

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、天平、水浴锅/恒温培养箱、台式低温离心机、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：

样本处理

组织：建议称取约0.1g样本，加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二进行冰浴匀浆。于4℃，8000g离心10min，取上清，置于冰上待测。

细胞或细菌：建议取500万细胞或细菌加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二，冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率200w，超声3秒，间隔10秒，重复30次），于4℃，8000g离心10min，取上清，置于冰上待测。

血清（浆）或其他液体：直接检测，若液体有浑浊则离心后测定。

二、测定步骤

紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

将工作液37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热10min。

取200uL样本和820uL工作液至1mL石英比色皿，混匀，立即记录340nm处20s的吸光值A1和80s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

乙酰辅酶A含量计算

按样本质