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凯氏定氮法测定食品中蛋白质的操作要点及注意事项、常见问题

蛋白质是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源，

具有不可替代的作用。含氮是蛋白质区别于其有机化合物的重要标志。在检验食品中蛋

白质时，通常是先检定出食品中的总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，以此得到蛋白质含

量。凯氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，至今仍被作为标准检验方法。凯氏定氮

法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定过程。

原理

向样品中加入浓硫酸和催化剂，充分混匀，然后加热消化分解，样中碳和氢被氧化成

二氧化碳和水，其中的有机氮转化为硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或

盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。

样品消化

浓硫酸具有脱水性和氧化性，可使有机物中的碳、氢被氧化为二氧化碳和水，蛋白质

会分解为氨，然后氨与硫酸结合生成硫酸铵。通常加入硫酸钾和硫酸铜作为催化剂来加快

蛋白质分解。硫酸钾可以提高溶液的沸点，一般情况下，纯硫酸的沸点在340℃左右，但

是在添加硫酸钾后，可提高至400℃以上。提高温度使有机物加快分解。但是不能加入过

多的硫酸钾，否则会因为温度过高，使生成的硫酸铵发生热分解成氨而造成损失。硫酸铜

除作为催化剂，还可以指示消化终点的到达，有机物全部消化完全后，溶液呈现清澈的

蓝绿色，硫酸铜还可以做蒸馏时碱性反应的指示剂。

蒸馏

消化液中的硫酸铵在碱性环境下会转化成氨。为防止水中微量的氨气受热逸出，影响

测定结果，所以水蒸气发生器中的水要保持酸性。硫酸铵是一种强酸弱碱盐，需要足够的

碱液使结合态的氨完全反应并释放出来，这个过程中的氢氧化钠一定要过量，过量的氢氧

化钠会与硫酸铜生成蓝色的氢氧化铜沉淀，氢氧化铜受热分解成黑色的氧化铜沉淀。检验

蒸馏是否完成，可用奈氏试纸法，NH4+或NH3遇奈氏试剂会反应生成棕红色的碘化汞铵

化合物。

吸收

加热蒸馏放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不

影响下一步滴定时指示剂的变色反应。温度过高会使硼酸吸收液对氨的吸收作用减弱，从

而造成损失，故一般不超过40℃。

滴定

待吸收完全后，用硫酸或者盐酸标准溶液进行酸碱滴定，滴定液的浓度直接影响结果

的准确性，必须按照要求进行配制和标定。混合指示剂在中性溶液中呈灰色，滴定终点时

液体呈灰色。

注意事项

①所用的试剂溶液应用无氨蒸馏水配制；

②取样应具有代表性,取样前将样品充分混匀；

③样品称量放入凯氏烧瓶时，切勿使样品粘附在瓶颈部，避免样品未消化完全而造成

氮损失；

④为了保证使烧瓶壁上的残渣消化完全，在消化过程中要不时地转动凯氏烧瓶；

⑤消化脂肪或糖含量较高的样品时，易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出，消化时应先

消化加热并不断摇动，或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂；

⑥当样品消化液浑浊或未澄清透明时，可先将凯氏烧瓶放冷至室温后，再加入30%的

过氧化氢，然后继续加热消化；

⑦加碱后，漏斗要进行水封，避免因装置漏气造成氨的逸出影响结果的准确性；

⑧要保证蒸馏装置不能漏气；

⑨在蒸馏时反应室与界存在的压力差，蒸汽可将氨带出。故蒸馏时，要保证蒸汽均

匀、充足，中间不能停止加热，防止发生倒吸；

⑩蒸馏前如果加碱后消化液呈蓝色而没有生成氢氧化铜沉淀，说明加入的碱量不足，

需要适量补加碱；,蒸馏时为防止水蒸气发生器液体爆沸，加入几片碎瓷片或大的玻璃珠，

玻璃珠直径最好大于联通的玻璃管直径，以免玻璃珠进入玻璃管影响蒸汽均匀、充足的

输出；-冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下，防止氨逸出，蒸馏完毕后先将冷凝管下端

提离液面，再蒸1min后清洗管口，再移开吸收瓶，最后关掉热源，否则可能发生倒吸。

常见问题解答

一、消化过程中容易沾壁怎么办？消化后定氮瓶有黑色残留物怎么办？

解答：称样时需要注意切勿使样品粘附在定氮瓶颈部，避免因样品未消化完全而造成

结果偏低。消化过程中如果发生沾壁在定氮瓶肚上或者定氮瓶肚上有黑色残留物，可以在

消化较完全时摇动定氮瓶，把定氮瓶肚上的黑色物质摇洗下来。摇动的方法是取下小漏斗，

戴上防烫手套，手掌紧握瓶颈，向前后侧甩，使瓶液体呈半旋转半振荡状态，注意控制