6磷酸葡萄糖酸脱氢酶说明书.docx

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货号：QS1106 规格：50管/48样

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-phosphogluconatedehydrogenase，6-PGDH）

说明书

紫外分光光度法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

磷酸戊糖途径途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）和6PGDH依次催化NADPH合成，与能量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外，6PGDH逆境生理中具有重要作用。

测定原理：

6PGDH催化6-磷酸葡萄糖酸和NADP+生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm吸光度增加速率，计算6PGDH活性。

自备实验用品及仪器：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前配制，加入5mL试剂一，混匀。试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前配制，加入5mL试剂一，混匀。

粗酶液提取：

组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

血清、培养液等液体：直接测定。

测定操作：

分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

试剂一置于25℃或者37℃水浴预热30min。

空白管：取1mL石英比色皿，依次加入100μL蒸馏水，100μL试剂二，700μL试剂一，100μL试剂三，于340nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。△A空白管=A2-A1

测定管：取1mL石英比色皿，依次加入100μL粗酶液，100μL试剂二，700μL试剂一，100μL试剂三，于340nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A3，第190s吸光值记为A4。△A测定管=A4-A3

注意：空白管只需要做一次。

计算公式：

按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmolNADPH的酶量为1个酶活单位。

6PGDH 酶活性(nmol/min/mg prot)= [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总

÷ε÷d×109]÷(Cpr×V样)÷T

按照样本质量计算

=535.9×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmolNADPH的酶量为1个酶活单位。

6PGDH酶活性(nmol/min/g)=[(△A测定管-△A空白管)×V反总÷ε÷d×109]÷(W×V样÷V

样总)÷T

=535.9×(△A测定管-△A空白管)÷W

按细胞数量计算

活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmolNADPH的酶量为1个酶活单位。

6PGDH酶活性(nmol/min/104cell)=[(△A测定管-△A空白管)×V反总÷ε÷d×109]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=535.9×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量

按液体体积计算

活性单位定义：每毫升液体每分钟催化产生1nmolNADPH的酶量为1个酶活单位。

6PGDH酶活性(nmol/min/mL)=[(△A测定管-△A空白管)×V反总÷ε÷d×109]÷V样÷T

=535.9×(△A测定管-△A空白管)

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.001L；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；V样：反应体系中加入粗酶液体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，3min。

注意事项：

样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在提取当日完成酶活性测定，粗酶液避免反复冻融；

试剂二和试剂三须现配现用，当天未用完试剂保存在4℃，可保存2天。