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DB32/T××××—2003
DB32/T××××—2003
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江苏省市场监督管理局发布-实施2024-发布鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及
江苏省市场监督管理局发布
-实施
2024-发布
鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程
Technologyproceduresforthediagnosis,prevention,andcontrolof
InfectiousSpleenandKidneyNecrosisinmandarinfish
DB32/T—2024
DB32
江苏省地方标准
ICS65.150
B52
DB32/T-2024
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鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程
范围
本文件规定了鳜鱼传染性脾肾坏死病的诊断、综合防控和记录。
本文件适用于鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的检测，鳜鱼传染性脾肾坏死病的诊断和综合防控。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB11607渔业水质标准
SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范
3术语和定义
本文件无术语和定义。
4诊断
4.1现场调查
水质情况包括水源、水色、水温、透明度、pH、亚硝酸盐、氨氮、溶解氧、硬度等；养殖情况包括养殖密度、苗种来源、饵料鱼来源等。
4.2临床诊断
患病鱼表现为沿池边漫游而死，鳃盖、口腔周围、下颌、胸鳍、腹鳍充血，鳃发白，解剖后肝脏呈现白色或有出血点，肾脏和脾脏肿大或有明显的出血点，部分胆囊肿大，部分幽门盲囊出血（图1）。
4.3检测方法
4.3.1试剂材料
无水乙醇（分析纯）；
三氯甲烷（分析纯）；
异戊醇（分析纯）；
1mmol/LEDTA，pH8.0；
1%SDS；
ddH2O；
10mmol/LTris-HCl，pH8.0，4℃保存；
Tris饱和酚，4℃保存；
8U/μLBstDNA聚合酶，-20℃保存；
10mmol/LdNTPs混合物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L），-20℃保存；
10000×SYBRGreenI，-20℃保存；
25mmol/LMgCl2，-20℃保存；
10×Thermopolbuffer，-20℃保存；
甜菜碱，-20℃保存；
10×PCRBuffer，-20℃保存；
5U/μLTaqDNAPolymerase，-20℃保存；
20mg/mL蛋白酶K，-20℃保存；
LAMP检测引物序列：
F3：5′-AACCACCAGGCAGAAATGG-3′
B3：5′-ATCCGAGGCGACGTCATC-3′
FIP：5′-TAAAGCCAAAGCCCACATCGGCGAAGACATGGTGCGCTACT-3′
BIP：5′-AAGCAAGTGCACAGCACCCGTCAAGCCTCGCACAGAGG-3′
巢氏PCR检测引物序列：
MCP-F1：5′-ATGTCTGCAATCTCAGGT-3′
MCP-R1：5′-TTACAGGATAGGGAAGCCTG-3′
MCP-F2：5′-GCGTTTGATGCGATGGAGAC-3′
MCP-R2：5′-ACGGCAGAGACACGGTAGGC-3′
4.3.2仪器设备
灭菌锅；
水浴锅；
PCR仪；
紫外分光光度计；
电泳仪；
电泳槽；
凝胶成像系统；
离心机。
4.3.3采样
采集样品的数量参见SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范。鳜鱼体表用75%酒精消毒后解剖剪解剖，无菌操作，剪取小块肾脏、脾脏、肝脏，匀浆后用于DNA提取。
4.3.4检测样本模板制备
利用酚-氯仿法抽提混合组织DNA。每个样品取组织100mg~200mg，匀浆后置于1.5mL微量离心管，加入含蛋白酶K的裂解液（10mmol/LTris-HCl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0；1%SDS），60℃消化1h~3h。
用Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）混合液提取、纯化DNA，-20℃冷冻的无水乙醇沉淀DNA，自然干燥，溶于灭菌ddH2O。紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。DNA样品置于-
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