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7.识别位点与切割方式之间的关系
A.识别不同，切割不同
eg:BamHIEcoRI
-GGATC?C- -A?GATCT-
-C?CTAGG--TCTAG?A-
B.识别不同，切割产生末端相同(同尾酶)
eg:BamHI Bg1Ⅱ
-A?GATCT-G?GATCC
-TCTAG?A-CCTAG?GC.识别相同，切割不同
eg:SmaI XmaI-CCC?GGG- -C?CCGGG-
-GGG?CCC--GGGCC?C-
D.识别相同，切割相同──同工酶?同裂酶eg:HpaⅡ MspⅠ
-CC?GG- -C*C?GG-
-GG?CC- -GG?CC-
甲基化后不可切割甲基化后仍可切割8.限制酶反应的影响因素
1.温度：一般37?C
有例外,如：SmaI25?C，BclI50?C，TaqI65?C
2.缓冲液：高、中、低盐之分
3.时间：1-2小时
4.反应体积和甘油浓度：酶1/10体积
5.DNA纯度与构型：A.纯度：RNA，蛋白，氯仿，SDS，EDTA，
EB，酚，乙醇，硫酸根，DNA
B.构型：切超螺旋需更多的酶
例:l?g?DNA,EcoRI切,1U
超螺旋pUCl9,EcoRI2.5U
HindⅢ5U
SalI10U
NarI20U
酶单位的定义：
1U：指在适当的温度和缓冲液条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的酶量。
缓冲液
NaCl 0,50,100mmol/L离子强度
Tris-HCl pH7.5-8.0
MgCl2辅助因子10mmol/L
DTT 抗氧化，保护还原性基团1mmol/L
BSA使蛋白酶稳定100ug/mL近末端的切割：
eg:AccIGGTCGACC? 切不动
CGGTCGACCG 切不动
CCGGTCGACCGG切不动
eg:EcoRIGGAATTCC CGGAATTCCG
2小时内90%完全酶切
eg:PmeIGTTTAAAC 20小时不能切
GGTTTAAACC20小时，25%切开
GGGTTTAAACCC20小时，50%切开
AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG20小时，
90%切开
星活性(StarActivity)
识别专一性下降
eg:EcoRI GAATTC
EcoRI*AATT
原因：甘油浓度过高，酶浓度太大，
离子强度不适，pH不适(Ph8.0)
存在有害试剂(1%乙醇,DMSO,乙二醇)
阳离子变化:Mn++,Co++,Zn++,Cu++代替mg++
酶的灭活
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