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Skyline数据非依赖性采集

数据非依赖性采集(DIA)1,2是一种用于大型靶向蛋白质组学实验的先进技术。在没有采集

预定的情况下，选择反应监测(SRM)和平行反应监测(PRM)等靶向采集方法仅能测量少量

肽段；在每次质谱运行进行预定的情况下，这些采集方法可测量数十到数百个肽段。而使

用DIA时可以测量更多的肽段（数千个乃至整个蛋白质组），相对于SRM，采用这种方法

时在灵敏度、选择性和再现性方面的牺牲并不大。DIA的另一个优点是无需预先指定或预

定所要测量的肽段，而是可以在运行DIA进行采集后，提取广泛的母离子质荷比范围内任

何所需肽段的子离子色谱图。

自2010年10月Skyline首次支持根据DIA数据提取色谱图以来，这项支持一直在定期改进。

从21.1版开始，Skyline支持多种常用的DIA数据分析策略和工作流程。Skyline还支持所有

具备DIA功能的仪器，其中包括SCIEX、Agilent、Bruker和Waters公司的Q-TOF仪器以及

Thermo公司的Q-Orbitrap仪器。

采用一种有效的DIA工作流程时，一开始就能在特定的仪器和色谱设置下运行任意多次初

步数据依赖性采集(DDA)。它有利于在运行DIA的同一台仪器上执行这些初步Shotgun测

量。但是，如果使用类似的分段技术和色谱法，也可以在仪器平台之间转移靶向分析。对

于这些初步的DDA测量，为达到更高的蛋白质组覆盖率，样品可能会被分馏或以其他方式

简化。DDA运行使用肽段谱图匹配管道进行处理，然后（在Skyline中）利用得到的肽段

ID的谱图和保留时间来创建谱图库和保留时间(iRT)库，或是（在其他工具中）创建叫做

“分析库”的扩展离子对列表（具备碎片离子子集的相似信息）。这些碎片离子相对丰度和

归一化保留时间(iRT)库可用于后续任意多次使用相同仪器和标准肽段进行保留时间校准

的DIA运行。

尽管有多种方法可将DDA搜索结果转换为适合该库DIA分析方法的库（在第2场Skyline

教程网络研讨会中描述为“先验知识工作流程”，此后在第14、15和18场网络研讨会以及

DIA/SWATH数据分析教程中都有更详尽的记录），但开始DIA分析的一种简单易行的方法

是在同一仪器上穿插DDA运行和DIA运行，将DDA结果的谱图和保留时间作为对DIA运

行的预测。

在本教程中，您将学习如何使用简单的DDA/DIA穿插方法在Skyline中设置、导入和处理

DIA运行。如果您要在研究中使用DIA，强烈建议您继续使用上面所列网络研讨会和教程

中阐述的更强大、更复杂的方法。

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入门指南

要开始本教程，请下载下列ZIP文件：

https://skyline.ms/tutorials/DIA-20_2.zip

请注意，这个文件非常大（下载大小为4.5GB，未压缩的大小为6.0GB），因为该文件包

含DIA运行，而DIA运行文件一般非常大，通常比SRM运行文件大100到200倍。如果下

载耗时太长或您的可用磁盘空间不足，也可以下载此处的精简版（下载大小为660MB，

未压缩大小为918MB）教程：

https://skyline.ms/tutorials/DIALibrary-20_2.zip

如果选择不含质谱原始数据文件的精简版，您需要跳过教程中的一些步骤，下文将会注明。

无论您选择哪个ZIP文件，下一步都是将其中的文件解压缩到您计算机上的某个文件夹，

例如：

C:\Users\damodei\Documents

该操作将创建一个新文件夹：

C:\Users\damodei\Documents\DIA-20_2

如果您在开始学习本教程之前就一直在用Skyline，最好将Skyline恢复为默认设置。要恢

复默认设置：

•启动Skyline。

•在起始页上单击空白文档，显示如下：

•在设置菜单中单击默认值。

•在询问您是否保存当前设置时，单击表单上的否。

该Skyline实例中的文档设置现已重置为默认值。

由于本教程涵盖蛋白质组学主题，因此您可以执行以下操作来选择蛋白质组学界面：

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•单击Skyline窗口右上角的用户界面控件，然后单击类似如下的蛋白质组学界面：

Skyline将在蛋白质组学模式下运行，