菠萝中提取蛋白酶.ppt

菠萝中提取菠萝蛋白酶分离纯化第二组背景知识菠萝蛋白酶是从菠萝皮和菠萝肉中提取到的一种蛋白酶，菠萝蛋白酶的生产可解决菠萝产业中大量废料被丢弃造成的环境污染和资源浪费问题，还可使菠萝产品高值化利用。由于菠萝蛋白酶对环境条件的敏感性，在其生产过程中活性易失，使得生产效率降低。菠萝茎和菠萝皮的含水量都达到85％以上，但菠萝茎的榨汁率比菠萝皮的榨汁率低。菠萝皮和菠萝茎中的糖分含量占总干重的80％左右，其中菠萝茎中淀粉占总糖份量的一半。离心可以有效去除榨汁中的不溶物质及菠萝茎中的淀粉，能部分去除果胶，对一些大分子悬浮物质去除困难。

背景知识菠萝蛋白酶在避光、低温条件下贮藏的酶活力损失最小。在55℃时具有最高的蛋白酶活性，40℃以上条件下酶活半衰期在2h以内，其热变性温度在55℃和60℃之间。金属离子对菠萝蛋白酶的酶活力具有影响，Ca2+引起的酶的失活速度最快；Fe2+和Cu2+对酶活力影响最大。准备知识在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度为0.2%沉淀蛋白的效果最好。菠萝蛋白酶提取时,pH值为6.5～8.5左右,温度为60℃,菠萝蛋白酶的活性最强,可作为最佳提取条件。实验原理蛋白质与单宁作用可以发生沉淀反应,所以可以用单宁提取菠萝蛋白酶。通过比活力测定菠萝蛋白酶的含量。实验所需材料与仪器实验用菠萝采自超市,以7～9分成熟为标准菠萝肉各部分分别经打碎、榨汁、纱布粗滤、离心(4000r/min,10min)后得澄清液,存放于冰箱中备用?5%柠檬酸钠?维生素c?单宁?0.1%EDTA溶液?1.5%氯化钠溶液?1%酪蛋白溶液?1mol/L氢氧化钠溶液?0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至7.0）?激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）榨汁机、离心机、分光光度计、水浴锅方法及流程鲜果肉汁混合液上清液混合液沉淀物酶糊复合物分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒入烧杯中,加0.1%EDTA溶液100ml搅匀,再将1.5%氯化钠溶液200ml倒人烧杯中搅匀,以4200r/min离心5min,倒掉上清废液,得到洗涤剂Ⅰ酶复合沉淀物。把洗涤剂Ⅰ酶复合沉淀物倒入烧杯中,加0.5%乙酸锌溶液20min,搅拌均匀,静止5min,加0.06%抗坏血酸溶液30ml,搅匀,静止5min,加1.5%氯化钠溶液20ml,搅匀,静止5min,最后再加0.5%EDTA溶液20ml,搅匀,静5min,以4000r/min离心7min,把上清废液倒掉,得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图菠萝蛋白酶活力的测定1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至10ml,离心得上清液；2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活剂；3、另取5支试管，分别对应标号A、B、C、D、E，各加1ml缓冲液和0.9ml激活剂；4、将10支试管置于37℃水浴；5、然后按左表操作酶活力鉴定3、保温恒定后，加入同样预热的0.1﹪干酪素，混匀，在37°C下准确反应。10min，加入8ml1mol/lNaoH溶液，迅速摇匀，于室温放置30min4、取上清液于275nm波长下测定OD值。数据的处理1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中蛋白酶的总质量m=0.140/6.2357x5=0.1123mg2、菠萝蛋白酶活力=0.868/10=0.0868U3、比活力=0.0868U/0.1123mg=0.7729U/mg结果讨论从上述结果可知菠萝蛋白酶的比活力较低，可能的原因有：1、所加入的有机酸单宁的量对菠萝蛋白酶沉淀有的影响；2、在实验中是否把单宁溶液弄混而导致菠萝蛋白酶很少沉淀析出；结果讨论3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否合理；4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足，导致结果偏低；5、在活力的测定步骤中，设置了几个梯度，最后的结果中应该有至少两支试管中的溶液的吸光度的值相同，但本组实验没有得到这种结果。6、活力测定中，由于操作不当，导致部分沉淀溶解在了上清液中，溶