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单细胞转录组测序在跨物种（人、大鼠、小鼠、猪）肾内细胞基因表达特征鉴定中的应用

Single-CellRNASequencingIdentifiesCandidateRenalResidentMacrophageGeneExpressionSignaturesacrossSpecies

中文题目：单细胞RNA测序鉴定跨物种肾内常驻巨噬细胞候选基因表达特征

发表杂志：JAmSocNephrol?

影响因子：8.655??

发表日期：2019-5

研究背景

常驻巨噬细胞调节包括肾脏在内的多种组织的稳态和疾病过程。尽管有明确的标记来识别小鼠中的这些细胞，但技术限制阻止了不同物种间相似细胞类型的识别。无法识别跨物种的常驻巨噬细胞群阻碍了从动物模型获得的数据向人类患者的转化。本研究以小鼠、大鼠、猪和人肾组织中所有除去T细胞和B细胞的CD45+先天免疫细胞scRNAseq分析为切入点，确定能够跨物种识别常驻巨噬细胞的新标记。

实验材料及方法

单细胞获得

小鼠：取8周大C57BL/6野生型雄性小鼠肾脏，用无菌刀片切碎(约0.15克)，并在37℃酶液消化30分钟。10xGenomics实验中，3只野生型雄性小鼠肾脏样本合并后用于测序。

大鼠：取3个月大的雄性Sprague–Dawley大鼠肾脏，称取约2.5g含有皮质和髓质的肾组织。用无菌刀片将肾切碎，在37℃用酶液消化30分钟。

猪：取6个月大的雄性猪肾脏。称取约2.5g含有皮质和髓质的肾组织。用无菌刀片将肾切碎，并在37℃用酶液消化30分钟。

人：在切除后4小时内从外科肾切除术中收集残余的人肾组织。对于scRNAseq，从一名60岁白人男性获得正常肾组织，其血清肌酐(0.8-1.2mg/dl)正常，有外生性3厘米病变。在3名成年患者(平均年龄63±8岁，两名男性和一名女性，两名白人和一名黑人)的相对未受影响的肾组织上验证了由scRNAseq鉴定的标记。肾组织用无菌刀刀片将2.5g含有皮质和髓质的组织切碎，并在37℃下酶液消化30分钟。

消化后，肾脏碎片通过70微米过滤器，获得单细胞悬浮液。细胞用溶液重悬，在室温下用相应抗体染色30分钟，小鼠：PEratanti-mouseCD45，BV786hamsteranti-mouseCD3e和PerCP-Cy5.5ratanti-mouseB220；大鼠：PEanti-ratCD45，APCanti-ratCD3和PE/Cy7anti-ratCD45RA；猪：mouseanti-pigCD45和Fitcmouseanti-humanCD3e，第二抗体包括Cy5donkeyanti-mouseIgG；人：PacificBlueanti-humanCD45，BV605anti-humanCD3和AlexaFluor647anti-humanCD19。所有物种都用FixableAquaDeadCellStain染色。加入一级抗体后，将细胞离心，在0.04%BSA中洗涤，再悬浮在1毫升0.04%BSA中。样本被采集到流式细胞仪中，并使用Becton-DickensonFACSAriaII进行分选。

FluidigmC1测序

Fluidigm单细胞cDNA文库制备。简单地，FACS分选后的巨噬细胞在Dulbecco-PBS中重新悬浮至最终浓度为300-350细胞/毫升，并与Fluidigm悬浮试剂混合，达到55%的最终浮力，这由预试验确定。将6微升混合细胞装载到FluidigmC1IFC平板中(10-17微米捕获位点)，用于mRNA序列。捕获的单细胞通过显微镜进行确认。接下来，裂解混合物、反转录混合物和预扩增混合物，最终构建的文库由IlluminaNextseq上测序。

10xGenomics

根据标准方法制备10xChromium单细胞文库。简单地，FACS分选的单细胞悬浮液、10x条形码凝胶珠和油被装载到Chip中，通过ChromiumController捕获凝胶珠乳液(GEMs)。全长cDNA文库是通过在热循环器中孵育GEMs制备的。将含有cDNA的GEMs破碎，并将所有单细胞cDNA文库聚集在一起，用DynaBeadsMyOneSilanebeads通过聚合酶链反应进行预扩增，之后进行标准的测序文库构建，之后用IlluminaNextseq对最终构建的单细胞文库进行测序。

实验结果

1）scRNAseq揭示小鼠肾脏先天免疫细胞聚类的不同

实验从肾脏中分离出除去淋巴细胞的免疫细胞群(CD45+)，并使用10xGenomics平台对细胞进行scRNAseq分析(图1A)。为了进行这项分析，研究者使用荧光标记抗体