基因工程学原理-第三章-全细胞DNA的提取(2003).ppt

*1、细胞DNA存在哪里？2、获取细胞内全部纯化的DNA，需要破除那些障碍？3、我们可以采取怎样的方法来破除这些障碍？一、培养细胞的生长和收集；二、细胞破碎并释放出内含物；三、除去细胞抽提物中除DNA以外的其他成分；四、得到的DNA溶液的浓缩即培养、破碎、除杂、（浓缩）。绝大多数细菌在液体培养基（肉汤培养基）中生长起来并不困难。培养基的要求：1、能够提供一个基本营养物的混合平衡体系；2、每种基本营养成分的浓度能够保证细菌有效的生长和繁殖。M9培养基是一种典型的确定成分培养基（definedmedium），其中所有成分都是可知的。这种培养基包含无机营养成分的混合物以提供基本元素，如氮、镁和钙以及葡萄糖，来提供碳源和能量。实际上，额外的生长因子如微量元素和维生素也必须加入M9中以维持细菌的生长。Luria-Berani（LB）培养基是一种更加复杂的不确定成分培养基（undefinedmedium），LB培养基包含哪些成分以及这些成分的含量都是未知的。这种培养基的两种主要成分：胰蛋白胨和酵母提取物。胰蛋白胨实际上负责提供氨基酸以及小的肽段，酵母提取物（酵母细胞部分消化后的干粉制备产物）负责提供氮源、糖类以及其他有机和无机营养。类似LB的混合培养基并不需要再另外补充成分并且能够维持种类范围很广的细菌的生长。培养物的生长状况能够通过读取600nm光密度（OD值）来进行检测，在该波长下每个单位的OD值相当于0.8x10v9个细胞／mL。裂解细菌细胞的技术大体上可以分为两种：物理方法和化学方法。物理方法指的是以机械力的方法打破细胞外的屏障来释放内含物。化学方法则是通过将细胞暴露在能够对细胞整体结构产生影响的化学药物中来对细胞进行破碎的方法。一般，化学方法比较常用。化学裂解通常包括一种能够攻击细胞壁的成分和一种能够除去细胞膜的成分。所用的化学物质通常使用到的是溶菌酶和乙二胺四乙酸盐（EDTA），或者两者相结合使用。溶菌酶是一种在鸡蛋清中存在的酶，并且在一些分泌物如眼泪和唾液中也存在，它能够消化掉赋予细胞壁坚固性的多聚混合物。另一方面，EDTA能够通过螯合除去对保持整个细胞外壁结构来说必不可少的钙离子，同时能够抑制一些能够降解DNA的细胞质中的酶。在某些条件下，用溶菌酶或EDTA来削弱细胞壁已经足以导致细胞膜破裂，但通常都还要加入一些去垢剂如十二烷基磺酸钠（SDS）。去垢剂通过移除液体分子并导致细胞膜破裂，协助了整个细胞外壁的裂解过程。两种途径：有机萃取和酶消化法去除杂质使用离子交换层析从细胞提取物中纯化DNA利用荷电量的不同能将混合物分离成各种单独组分以达到纯化DNA的目的。由于细胞提取物中不同分子核电量不同，其与层析分离基质（也称树脂（resin））的结合紧密程度也不同。DNA和RNA（包括一些蛋白质）都是带负电的，它们能够结合在带正电的树脂上。通过逐渐增加盐离子浓度，不同类型的生物分子就逐一从树脂中分离下来。有机萃取的方法常能得到浓度非常高的DNA溶液，没有必要进行进一步的浓缩。其他分离方法得到较稀的DNA溶液，需要浓缩增加DNA溶液的浓度。最经常用到的浓缩方法是乙醇沉淀（ethanolprecipitation）。在盐（严格来说是单价阳离子如钠离子）存在的条件下。处在-20℃或更低一些的温度，纯的乙醇能够有效地使多聚核苷酸沉淀。DNA浓度能够通过紫外吸收分光光度测定法进行测定。被DNA溶液吸收的紫外线的量能够正比于样品溶液中的DNA含量。通常吸收量在260nm被测量，在该波长情况下，1.0的吸收值对应于每毫升中50μg双链DNA。紫外吸收还能够被用来检测DNA制备物的纯度。对纯净的DNA样品，在260nm和280nm的吸收量之比应为1.8。如果实际测量时这个比例小于1.8的话，就表示样品被蛋白质或苯酚污染了。对于不同类型的细胞，在进行全细胞DNA提取时的操作步骤都一样吗？1、细胞的的培养液体培养基只适合于细菌、其他微生物和动植物细胞的培养。2、细胞的破碎破碎细菌细胞时所使用的化学物质对其它生物细胞并不总是适用，比如说，溶菌酶对植物细胞就毫无作用。专一性的降解酶对绝大多数的细胞壁都适用，但是通常一些物理方法，比如用研钵和乳钵对冷冻的材料进行研磨要更有效。另一方面，绝大多数动物细胞根本就没有细胞壁，仅仅用去垢剂处理就能去掉外被。3、细胞提取物对于绝大多数细菌细胞来说，主要的细胞提取物就是蛋白质、DNA和RNA,因此苯酚提取或蛋白酶降解，接下来利用核糖核酸酶分解RNA，就能够得到纯净的DNA样品了。然而，对于植物细胞组织等细胞中还含有大量的其它生