免疫荧光细胞化学技术.ppt

2共聚焦成像原理激光器发出的激光束经过光的扩束和整形，变成一束直径较大的平行光束，长通分色光镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发出沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜，长通分色反射镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜的焦点外，经过焦点处的针孔，由检测器接收并转变成电信号。3光信号接收和成像方式

(1)光信号接收生物样品发出的荧光通常有二种接收方式：①由光电倍增管（PMT）把光信号转变成电信号；②利用电荷耦合器（CCD）把光信号转变成电信号。(2)成像方式①载物台运动成像：以直径很小的激光束照射样品，照射点发出的荧光信号经PMT变成电信号，然后载物台移动到下一点，记录该点的荧光强度。该方法无轴向像差，成像时间长；②反射扫描成像方式，通过转动反射镜使激光连续照射样品，由CCD摄像机记录下照射点所发射的荧光，成像速度快。第41页,共44页，2024年2月25日，星期天第42页,共44页，2024年2月25日，星期天4参数的选择

基本参数：Confocal,pinhole,detector,

PMT,Stepsize,Xpoints,YPoints,scanstr,speed,LaserPwr,Autozoom,Display,BRsubval,Samples/pt等5性能特点：分辨率高，灵敏度高，扫描速度快，扫描范围大，图像存取方便，可进行光切片的观察，可进行定量荧光分析。第43页,共44页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第44页,共44页，2024年2月25日，星期天(1)异硫氰酸荧光素(FITC)呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现黄绿色荧光。在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子2荧光素的种类：最大吸收光谱：490～495nm，最大发射光谱：520～530nm。分子量：389.4KD第9页,共44页，2024年2月25日，星期天(2)四乙基罗达明(RB200)褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈明亮橙红色荧光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。最大吸收光谱:570nm最大发射光谱:596～600nm分子量：580KD第10页,共44页，2024年2月25日，星期天(3)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC)紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可用于双标记示踪研究。最大吸收光谱:550nm最大发射光谱:620nm(4)4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）---蓝色荧光(5)得克萨斯红（Texasred）(6)藻红素R(7)花青（Cyanine,Cy2绿色,Cy3红色,Cy5）…第11页,共44页，2024年2月25日，星期天三、荧光素标记抗体的方法

(一)FITC标记抗体的方法

1Marsshall法

(1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应时，主要是抗体分子上的赖氨酸-氨基与FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。荧光素FITC-N＝C＋N-蛋白质→FITC-N–C–N-蛋白质‖