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Note:thisprotocolwillbesubmittedtoNatureProtocol(aninvitedsubmissionbyNatureProtocol,
)
High-efficientthermalasymmetricinterlacedPCR(hiTAIL-PCR)
Yao-GuangLiuandYuanlhen
SouthAgriculturalUniversity
Ahigh-efficientthermalasymmetricinterlacedPCR(hiTAIL-PCR)procedureforisolation
oflargeunknowntargetsequencesthatflankknownsequencesisdescribed.Along(33-34
nucleotides)arbitrarydegenerate(LAD)primerwithahigherdegree(2304or6912folds)
ofdegeneracyisusedtocreateprimer-bindingsitesefficientlyalongtheunknowntarget
sequences.Anadditionalsequence(18nucleotideswithTm=58°C)identicaltothe5’part
oftheLADprimeristaggedtothe5’endofalongprimer(Tm68°C)specifictothe
knownsequence.Thisspecificprimerandashorterprimer(16nucleotideswithTm=52°C)
forthecreatedLADsitesareusedfortheprimaryTAIL-PCR.Thisdesigncombinesthe
advantagesoftheTAIL-cyclingandsuppressioR,thuscanblocktheamplificationof
bothnon-targetproducts,andsuppressestargetproductsofsmallsizes,whileallows
efficientamplificationoflargetargetsequences.
INTRODUCTION
taggingbyT-andtransposoninsertionshasbecomeanimportantapproachforstudy
offunctionalgenomicsinnts.Withthisapproachlargenumberof-insertionlinesand
importantmutationshavebeencreatedinArabidopsisandrice.Toidentifythegenestaggedby
insertions,itisnecessarytorecovergenomicsequencesflankingtheinsertiontags.
However,thetaggedgenesequencescannotbeobtainedsimplybyregularPCRprocedures
becausethegenomicflankingsequencesareunknown.SofarseveralPCR-basedmethodssuch
asinversePCR1,2，adapter-ligationmediatedPCR3-6,andthermalasymmetricinterlaced(TAIL-)
PCR7,8,havebee
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