实验二-离子交换法回收谷氨酸——完结1.docVIP

生物工程专业实验之二离子交换法回收谷氨酸

实验目的

1.掌握新树脂的预处理方法及动态离子交换的基本操作；

2.了解谷氨酸提取的原理和方法。

实验原理

离子交换树脂的选择主要依据被分离物的性质和分离目的。包括被分离物和主要杂质的解离特性、分子量、浓度、稳定性、所处介质的性质以及分离的具体条件和要求。然后从性质各异的多种树脂中选择出最适宜的进行分离操作。

其中最重要的一条是根据分离要求和分离环境保证分离目的物与主要杂质对树脂的吸附力有足够的差异。当目的物具有较强的碱性和酸性时，宜选用弱酸性弱碱性的树脂。这样有利于提高选择性，并便于洗脱。如目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物质时，往往选用强碱、强酸树脂。如氨基酸的分离多用强酸树脂，以保证有足够的结合力，便于分步洗脱。对于大多数蛋白质，酶和其它生物大分子的分离多采用弱碱或弱酸性树脂，以减少生物大分子的变性，有利于洗脱，并提高选择性。

就树脂而言，要求有适宜的孔径，孔径太小交换速度慢，有效交换量下降(尤对生物大分子)，若孔径太大也会导致选择性下降。此外树脂的化学稳定性及机械性能也需考虑。在既定的操作条件下有足够的化学耐受性和良好的物理性能以利操作。一般树脂都有较高的化学稳定性，能经受酸、碱和有机溶剂的处理。但含苯酚的磺酸型树脂及胺型阴离子树脂不宜与强碱长时间接触，尤其是在加热的情况下。对树脂的特殊结合力也要给予足够的注意，如树脂对某些金属离子的结合以及辅助力的作用。

氨基酸为两性电解质，等电点较低的谷氨酸在pH小于pI3.2时，主要以GA+型式存在，故可用强酸性阳离子交换树脂提取。当发酵液流过交换柱时，发酵液中各成分依亲和力的不同进行交换。吸附GA的树脂再用洗脱液(5%NaOH)洗脱，收集富含GA的流分(高流液)。从而实现与杂质的分离及GA的富集，高流液调等电点pH3.2，GA结晶析出。用过的树脂用稀酸再生以用于下轮交换（图1）。主要化学反应有：

交换：RSO3H+NH4+=RSO3NH4+

RSO3H+GA+=RSO3GA+H+

洗脱：RSO3—GA++NaOH=RSO3Na++GA++H2O

RSO3—GA++NH4OH=RSO3NH4++GA++H2O

再生:RSO3Na++HCl=RSO3H+NaCl

图SEQ图表\*ARABIC1GA离子交换操作循环

本实验所用树脂为732型苯乙烯强酸型阳离子交换树脂。732型树脂的理论交换容量为4.5毫克当量/g干树脂（本组上次实验结果为3.3116mmol/g干树脂），最高工作温度为90℃，使用pH范围1-14，对水的溶胀率为22.5%，湿密度为0.75-0.85g/ml。

其中732型树脂对阳离子亲和力大小顺序依次为：

Ca2+＞Mg2+＞K+＞NH4+＞Na+＞碱性氨基酸＞中性氨基酸谷氨酸天冬氨酸

则洗脱顺序为：中性氨基酸，碱性氨基酸，Na+，NH4+，K+，Mg2+，Ca2+。

实验仪器与药品

仪器：离子交换柱（1.5×40cm）、若干试管、铁架台、滴定管、量筒、止水夹、小烧杯等；

药品：732（H）树脂、GA发酵液、5%NaOH，5%HCl等。

实验步骤

1.树脂的装柱与洗涤

1.1将干树脂在烧杯中用水浸泡一定时间，充分溶胀后（注：务必不可干树脂直接装柱，以防树脂溶胀挤破柱子），倾去溶胀时溶出的杂质及碎小树脂；

1.2用量筒量取40ml湿树脂（732，Na型），于小烧杯中带水在搅动悬浮下倒入柱中（可借用漏斗）将柱下端的止水夹打开，使柱内水慢慢流出，树脂自由沉降，保持柱中水位高于树脂床2-4cm，（以防树脂夹杂气泡），关闭止水夹；

2.转型

2.1树脂经洗涤后转化成所要的型式以供交换。为使转型完全，通常用过量试剂（再生剂）在离交柱中进行。本实验用5%HCl流洗至流出液pH＜0.5，即Na型732转化成H型，再用蒸馏水洗至近中性即可进入交换。（以上两步本次实验前已做好）

3.上柱交换

3.1用量筒量取一定体积的湿树脂，抽干水分，称取重量；

3.2将数值倒于小烧杯中搅动悬浮下倒入柱中，将柱下端的止水夹打开，使柱内水慢慢流出，树脂自由沉降，保持柱中水位高于树脂床2-4cm，（以防树脂夹杂气泡），关闭止水夹；

3.3将调配好的稀GA发酵液（pH4、GA1.5%，已除菌体用泵从贮液瓶中正上柱（工业上为常温带菌体反上柱）控制好流速（30滴/min、6-8床体积）慢慢加入交换柱；

3.4流出液用烧杯（500ml）收集，在收集过程中需不断用茚三酮显色剂（灵敏度为2μg/ml）检验柱下流出液，若有紫红色反应，证