第九章(3)---体外受精技术.ppt

体外受精技术一、概述1.哺乳动物正常体内受精＋＝2.为了提高动物繁殖率，家畜体外受精技术在20世纪80年代初研究成功，并在近10年得到逐步完善宫腔内人工授精（IUI）早在1878年，德国科学家Schenk就开始进行哺乳动物卵子体外受精的尝试。20世纪40年代，世界上也只有为数不多的科学家能成功的进行哺乳动物体外受精试验。美国的Pincus和日本的Yamane是这时期的代表。这期间，Rock和Menkin（1944）进行了人卵体外受精实验。美籍华人张明觉在1945年曾成功的进行了兔体外受精，但在此后的5年里没有能再重复出这一结果。这个时期的体外受精工作主要建立在经验基础上。

1951年，Chang和澳大利亚的Austin几乎同时发现只有在雌性生殖道内停留一段时间的精子才能成功的与卵结合，进行体外受精。精子获能现象的发现是体外受精史上的一个里程碑。

1959年，Chang利用获能处理的精子进行体外受精实验，获得世界上首例“试管动物”——试管兔，为哺乳动物体外受精工程奠定了基础。

1963年，Yanagimachi和Chang首次报道了成功进行精子体外获能的实验。次年，他们详细发表了这项以金黄仓鼠为实验材料的重大研究。1978年7月25日，第一例试管婴儿LouiseBrown在英国诞生，这是体外受精技术走向全面应用的标志性事件，是医学和生物学上的一次伟大的革命。

80年代以来，由于对胚胎需求量的加大，促进了家畜体外受精的研究，牛、绵羊、山羊、猪等相继获得了成功，国内在90年代也在家畜上取得了成功。

现已将卵母细胞体外成熟—体外受精—早期胚体外发育，甚至冷冻保存结合在一起，建立工厂化生产胚胎的成套技术，以大量生产质优价廉的胚胎。二、精子的制备及获能2.精子的分离与制备是体外受精技术中的一个关键环节精液中的精子获能抑制因子冷冻精液中的防冻剂和蛋黄等成分影响和干扰受精的完成过多的留在受精液中的死精子①悬浮法（swimup）：是筛选高活力精子最为有效的一种方法。②玻璃棉（glasswool）过滤法：该法可有效地滤除品质较差精液中的死精子，大提高精子的受精穿透率。③BAS/哌可（Percoll）密度梯度离心法：采用不连续的BSA密度梯度可以分离得到形态正常的高活力精子。④离心洗涤法：对于精子活力较好的精液可采用直接离心洗涤法制备用于体外受精的精子。目前精子的获能处理方法主要有：①与血清白蛋白的溶液长时间孵育：原理是血清中白蛋白具有很强结合胆固醇和锌离子的能力，可除去质膜中部分胆固醇和锌离子，改变精子质膜的稳定性，导致精子获能。②用高离子强度溶液处理精子：精子表面的去能因子（被膜蛋白），当用高离子强度溶液处理精子时，将从精子的表面脱落，从而导致精子获能。③与含有卵泡液的培养液进行孵育：在培养液中添加一定浓度的卵泡液将有可能诱发精子获能。④使用钙离子载体A23187：直接诱发Ca2+进入精子细胞内部，提高细胞内的Ca2+浓度，从而导致精子获能。⑤使用肝素：是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，当它与精子结合后，能引起Ca2+进入精子细胞内部而导致精子的获能。是一种接近于体内获能的生理性方法，已经成为动物体外受精应用最广的一种精子获能方法。三、卵母细胞的采集及体外成熟1.卵母细胞的离体采集母畜屠宰后，在30min内取出卵巢，放入盛有灭菌生理盐水或PBS的保温瓶内（25－35℃）中，在3h内送回实验室，然后按照下述方法进行回收。①卵泡抽吸法：用注射器套上12－16号针头，