离心分离技术原理和操作.docx

第一篇生物化学与分子生物学

常用实验原理与技术

第一章离心分离技术

离心分离技术是利用离心机旋转所产生的离心力，根据待分离物质的大小、形状、密度等的不同而使物质分离的技术。离心分离技术在生物大分子的分离、纯化、鉴定，细胞和细胞器的收集等方面已得到广泛应用，成为生物化学与分子生物学实验室中常用的技术方法。

第一节离心分离技术的基本原理

一、离心力和相对离心力

当离心机的转子以一定的速度旋转时，离心场中的颗粒受到一定的离心力。离心力（Fc）的大小取决于颗粒的质量（m），颗粒旋转的角速度（ω）和颗粒的旋转半径（r）：

由于在转速相同的条件下，各种离心机转子的半径不同，离心管至旋转轴中心的距离不同，所受离心力也不同，因此文献中常用“相对离心力”表示离心力。相对离心力（RCF或g值）是指在离心力场的作用下，颗粒所受离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度g（9.8m/s2）。相对离心力取决于旋转半径r(单位为cm)和转速n(单位为r/min)，其计算公式为：

二、沉降速度与沉降系数

沉降速度是指在离心场的强大离心力作用下，单位时间内物质颗粒运动的距离。沉降速度与颗粒本身的性质、介质的性质和离心条件有关。

上式中v为粒子移动的速度，d为球形粒子直径，η为液体介质的粘度，ρp为沉降颗粒的密度，ρm为液体介质的密度。从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方成正比，与粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加。

1924年Svedberg对沉降系数下的定义为颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度，用“S”表示，S=v/ω2r。S是沉降系数，ω是离心转子的角速度，r是颗粒的旋转半径，v是沉降速度。沉降系数是以时间表示的，S值一般在1~200×10-13秒范围，为了纪念Svedberg对离心技术所做的贡献，把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒，1S=10-13秒。例如，动物细胞的核糖体沉降系数等于80S，它的含义就是：80×10-13秒。沉降系数与颗粒的形状、大小、密度和介质的密度、黏度有关。沉降系数越大在离心时越先沉降下来，细胞及细胞的各组分的沉降系数有很大的差异，所以可以利用沉降系数的差异采用离心技术将他们分开。

由沉降系数根据Svedberg公式可以计算出物质的相对分子质量：

上式中，Mr为相对分子质量，R是气体常数，T为绝对温度，S20,w是以20℃的水为介质时颗粒的沉降系数，D20,w是以20℃的水为介质时颗粒的扩散系数，γ是偏比容，等于溶质粒子密度的倒数，ρ为溶剂密度。

三、沉降时间

沉降时间为待分离颗粒在转头按给定的特性曲线运转的条件下，全部沉降所需要的时间。沉降时间取决于颗粒沉降速度和沉降距离，沉降时间常通过多次试验获得。如果已知颗粒的沉降系数，也可通过下式计算其沉降时间：

上式中，S为沉降系数，x2为离心转轴中心到离心管底内壁的距离，x1表示离心转轴中心到样品溶液弯月面之间的距离。

第二节离心机的种类及应用

离心机根据转速的不同可分为低速离心机、高速离心机和超速离心机。

一、低速离心机

低速离心机又称常速离心机，一般转速6000r/min，RCF6000g。常用于分离细胞、细胞碎片、较大的细胞器及粗颗粒沉淀等。低速离心机的操作方式、结构特点多种多样，可根据需要进行选择。低速离心机大多数在室温下操作，转速控制不够准确。

二、高速离心机

转速在10000~25000r/min，RCF在10000~100000g。高速离心机主要用于短时间内分离各种沉淀物、细胞碎片、各种细胞器，但不能有效沉淀病毒、小细胞器、蛋白质等大分子。有些高速离心机有制冷装置，称为高速冷冻离心机，速度和温度控制较准确、严格。

三、超速离心机

超速离心机的转速在25000~80000r/min，最大RCF可达600000g。为防止离心过程中温度升高，超速离心机均有冷却系统和温度控制系统；为了减少摩擦和阻力，还装有真空系统。超速离心机主要用于分离分子小的细胞器、病毒、核酸、蛋白质、多糖等生物大分子。

第三节离心分离方法

一、差速离心法

差速离心法是最普通的离心法，采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。

差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，大颗粒先沉淀，取出上清液，加大转速再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心，使不同大小的颗粒分批分离。差速离心法所得的沉淀是不均一的，含有较多杂质，需经过若干次的再悬浮和再离心