分子生物学常用技术.ppt

PCR技术

;

PCR(PolymeraseChainReaction)

Threesteps:denaturation,

primerannealing,

polymerization.

;ThePCRcycle;

历史

60s-70s：基因的体外分离技术。

Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年诺贝

尔医学奖得主“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

核酸体外扩增最早设想遗忘:

当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物；

当时(1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能

;KaryMullis(1985)

发明过程

Mullis在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:

“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。

发展过程：

开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。;专利官司

1987年美国专利局专利授权

1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。

美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus

Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器

;PCR发展速度

惊人，没有一种技术能与之相比

引用论文最多、应用范围十分广泛

1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家MichaelSmith共获

;原理

类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

;procedures;Primerdesign

Mostimp.

(1)length:20～30bp

(2)G+Ccontents:ATCGrandomdistributed

(3)primers:nocomplementarysequence

(4)3‘endoftheprimer:nomodification

(5)5‘endoftheprimer:productlength，canbe

modified

(6)specificity:lessthan70%homologywithnon-specificamplificationsequence,or8bp

continuouscomplementarybase;Primerdesignedwiththehelpofcomputer

DNAdatabase

conservativeregioncomparision

primersorblast

;PCRreactioncomponentsandtheirfunctions

template：ssDNA,dsDNA

mRNAneededtobeRTascDNA

samples：fromblood,spermoranyothertissue,fromolderforensicspecimens,fromancientbiologicalsamplesorinthelab.Frombacterialcoloniesorphageplaques.

DNA：verystable

;primes

IfthePCRproductistobecloned,itissensibletoincludethesequenceofuniquerestrictionenzymesiteswithinthe5’-endsoftheprimers.

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