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篮式反应器发酵POV过程中连续收获病毒的可行性研究

赵立民

(广东温氏食品集团股份有限公司研究院，广东新兴527400)

摘要：应用NBS篮式细胞反应器高密度培养PK一15细胞，接种Pcv中，使之在培养瓶中能够正常生长传代。细胞传代培养后2天，检

病毒后，采取边补加维持液边收获病毒液的方式，最终收获相当测细胞培养液PCV2抗原，确认阳性后利用细胞工厂扩大培养该细

于反应器约3倍体积的高滴度病毒抗原，生产效率明显提升，证明胞，作为反应器发酵的细胞种，期间重复检测细胞培养液PCV2抗

该工艺具备可行性。原，确保细胞能够持续保持阳性结果。

关键词：反应器；片状载体；PK-15细胞；PCV；连续收毒篮式反应器装填1000g片状载体，原位高压灭菌后接种PK一15

细胞，接种密度210个／ml接种，采用灌注培养方式进行高密度

猪圆环病毒(porcinecircovirus，PCV)属圆环病毒科圆环培养。5～6天后，细胞达到最大生长密度，排空培养液，注入维

病毒属，有PCV1和PCV2两个血清型，其中PCV1为非致病性的持液。注入维持液后约36h后开始少量收获病毒液，此后每隔12h

病毒，PCV2为致病性的病毒，是引起断奶仔猪多系统衰竭综取样4℃保存，待检病毒效价。收获病毒液时应用篮式反应器自带

合征(PMWS)、仔猪先天性震颤(CT)、猪皮炎肾炎综合征的蠕动泵，一边收获病毒培养液一边向反应器内补加等体积的新

(PDNS)等多种疾病的主要病原]，成为当前威胁我国养猪业的鲜维持液，流速以能够维持反应器内培养液的一定量的葡萄糖浓

主要猪疾病病源之一。度为准，并保证反应器内的培养液体积维持在30～32L范围内。

目前国内兽苗企业通常采用转瓶或反应器发酵技术生产PCV每隔4h取样检测培养液中葡萄糖浓度，以便及时调整流速。当细

病毒抗原，采用一次性收获病毒的工艺，并使用氨基葡萄糖作胞日均耗糖量下降No．5gL／UX下，耗氧曲线有明显下降趋势时，即

为添加剂促进病毒扩繁。虽然该工艺均可获得较高滴度的抗原，刻终止细胞发酵，收获全部病毒液，放入4℃冷柜保存。反应器内

但是病毒液收获量只相当于细胞培养体积，产率不高]。注人事先配制好的0．1mol／LNaOH溶液，灭活罐体内病毒，防止实

篮式生物反应器是美国NBS公司产品，具有剪切力小、自动验室内扩散。

控制精准、操作简单等特点】。与其配套使用的片状载体内部具将上述流程中维持的葡萄糖浓度分为1．Og／L、1．5g／L、2‘：0gL／3

有网格状结构，可以为细胞生长提供高生长面积／容积比，lg载体个梯度，分别进行PCV2病毒发酵，相应的实验命名为实验l、实

可提供1200cm的生长面积，利于细胞高密度生长)。PCV是典型验2、实验3，将测定的数据与常规方法(不更换维持液，直接收

的细胞外分泌型病毒，在病毒复制的过程中宿主细胞不会立即裂获全部病毒液)实验4做对比。所收获的病毒溶液测定效价后全部

解死亡，本文根据PCV的这一特点，采用篮式反应器与片状载体使用0．1molL／NaOH溶液做灭活处理。

大规模培养PK一15细胞，在收毒方法上进行了连续收获病毒液的病毒毒价测定采用ELLSA试剂盒法，结果用吸光度值表示，

尝试。无单位。

1材料和方法1．3结果

1．1材料如下图、表，实验1～3的收获病毒结束时间分别为125h、

1_1．1细胞系与病毒133h、136h，实验4在接毒后72h~t]达毒价峰值，此时收获最佳，

PK一15细胞，购自ATCC，100—150代；PCV2病毒，同业赠如不收获，毒价将持续降低。采用连续收毒方式，收获病毒的时

送，经特定处理后无致病性，