动物疫病免疫抗体血清学检测方法（动物实验室诊断技术）.pptx

酶联免疫吸附实验01原理02操作方法

原理Part-1

原理一酶联免疫吸附实验（ELISA）概述酶联免疫吸附试验，简称ELISA，是实验室最常用的检测方法。酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有人造催化剂。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。

原理一间接ELISA的基本原理其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原受检抗体复合物，再用酶标二抗（针对受检抗体的抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，可用目测或用分光光度计定量测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。

操作方法Part-2

操作方法二(一)实验准备：

操作方法二（二）：基本实验步骤

操作方法二（三）、基本操作方法

操作方法二四：结果判定

操作方法二（五）、注意事项ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下几点：（1）试剂盒从冷藏环境中取出时，必须平衡至室温后，方可开封启用。（2）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在15－30℃，使用前先预热仪器15－30分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应详细阅读说明书。（3）比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。（4）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。（5）加样时注意事项：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。

虎红平板凝集实验01原理02操作方法

原理一虎红平板凝集试验是用来诊断布氏杆菌病。布氏杆菌病是由布氏杆菌引起的人畜共患的急、慢性传染病。因接触病畜或食用受染牛奶或奶制品而感染。潜伏期1-3周，临床特点是缓慢起病，长期发热、多汗、虚弱、全身痛和关节痛，急性期症状多在3-6月内消退。虎红平板凝集实验又称班氏孟加拉红平板凝集实验，由于所有的抗原是酸性（ph3.6-3.9）带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性，检查的抗体是IgG类，因此提高了反应的特异性。

操作方法二(一)材料准备：抗原、标准阳性血清、阴性血清由制标单位提供，按说明书使用受检血清应新鲜，无明显蛋白凝块，无溶血和腐败气味虎红平板凝集反应纸吸头，适用于滴加0.03ml牙签或火柴杆，供搅拌用

操作方法二（二）操作方法：将虎红平板纸上加相应血清0.03ml。在受检血清旁滴加抗原0.03ml。用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。每次试验应设阴、阳性血清对照。

操作方法二（三）判定：在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。受检血清在4min内出现肉眼可见的凝集现象者判为阳性（+），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为（-）。

血凝试验的操作步骤一血凝试验（1）取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1～10孔内加入25μL生理盐水，第11孔不加。第12孔加25μL生理盐水。（2）在第1孔内加入标准抗原25μL，混匀后吸出25μL加入第2孔内，再混匀后吸出25μL加入第3孔内，依次类推至第10孔时弃掉25μL，第12孔不加作阴性对照孔。（3）在1～12孔均加入25μL的生理盐水。（4）在每孔内加入25μL1%的鸡红细胞悬液，震荡，室温静止感作30min～40min，以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。记录结果

血凝试验的操作步骤二

血凝试验的操作步骤三3.4单位病毒配制计算出含4个血凝单位的抗原浓度。按以下公式进行计算：抗原应稀释倍数=血凝滴度/4。例如血凝效价为1∶320，为1个单位，4个单位即为1∶80稀释。正式实验前经校对取4个血凝单位用于实验。

血凝抑制试验的操作步骤与注意事项一血凝抑制试验（1）取96孔V型反应板1块置于水平实验台上，在第1排1～10孔内加入25μL生理盐水，第11孔不加。第12孔加25μL生理盐水。（2）在第1孔内加入被检血清25μL，混匀后吸出25μL加入第2孔内，再混匀后吸出25μL加入第3孔内，依次类推至第10孔时弃掉25μL。第12孔不加作阴性对照孔。（3）在1～12孔内均加入“四价”