种苗快繁脱毒技术-脱毒苗鉴定课件讲解.pptxVIP

种子生产基础;目录;直接检测法;直接观察植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒可见症状，从而可判断病毒是否存在。如矮缩病毒引起寄主植物叶片腿绿、坏死、扭曲、植株矮缩，花叶病毒引起寄主植物叶片脉间失绿等。

简便、直观、准确。

;指示植物法;对某种或某几种病毒及类似病原物或株系具敏感反应并表现明显症状的植物称为指示植物。;（一）草本指示植物鉴定

1．汁液涂抹法：取待测植物幼叶1～3g，加少量水及等量0.1mol/l磷酸缓冲液磨成匀浆。在指示植物叶上涂上一薄层500～600目的金刚砂，用脱脂棉球蘸匀浆在叶片上轻轻摩擦，以汁液进入细胞又不损伤叶片为度。5min后，以清水冲洗叶面多余的匀浆及金刚砂。置放虫网内数天至数周。观察是否有症状。;汁液涂抹法的操作步骤;苹果茎沟病毒昆诺藜鉴定;2．小叶嫁接法

取待测植物小叶嫁接到指示植物叶上，根据被嫁接指示植物叶上有无病毒症状，鉴定待测植物病毒。每株指示植物至少嫁接2片小叶，若待测植物有病毒，嫁接后15～25d，即会产生症状。;（二）木本指示植物鉴定

1．直接在指示植物上嫁接待检植株的芽片。

２．双重芽嫁接

先将指示植物的芽嫁接到实生砧木基部距地面10～12cm处，再在接芽下方嫁接待检植物芽，两芽相距2～3cm。成活后剪去指示植物芽上部砧干。夏秋季芽接，次年可观察。;（3）双芽嫁接法

在休眠期剪取指示植物和待检植物的接穗，萌芽前分别把带有两芽的指示植物接穗与待检植物接穗同时切接在实生砧木上，指示植物接穗接在待检接穗上方。;抗血清鉴定法;（一）原理

人和动物感病后，血清中会产生抗体。刺激抗体产生的物质多为蛋白质，称为抗原。抗原与抗体间能发生高度专一性的反应，称为血清学反应（免疫反应）。;抗体存在于血清中，故叫抗血清。植物病毒是核酸和蛋白质组成的复合体，因此，也是一种抗原，注射到动物体内，会引起相应特异抗体的产生。因此，利用特定病毒的抗血清．通讨血清学反应即可检测该种病毒。

;抗血清鉴定方法专一性强、快速简便。

分离纯化病毒（抗原），制??纯净的抗血清是抗血清鉴定中最关键的环节。

植物病毒抗血清的制备方法是：先提取、纯化植物病毒，将高纯度病毒注射到动物（如家兔、山羊、老鼠）体内，再从动物血液中提取和纯化抗血清。;（二）方法

1．叶绿体凝集法采用待检植物叶片提取液与专一抗血清发生凝结反应检测植物病毒，如烟草花叶病毒，马铃薯Y病毒等长形病毒

2．试管沉淀法即各种稀释的抗血清与病毒抗原在小试管中混合反应而产生沉淀，是常用的病毒检测方法之一。长形病毒形成絮状沉淀，球形病毒形成浓密粒状沉淀。

;3．环形接口法在毛细管或细长玻管中，抗原抗体通过扩散结合。病毒抗原位于上部呈层状，少量抗血清向毛细管渗入，至达到足够的抗原/抗体比率时，在该区域产生可见沉淀物。此法简单快速。;基本原理是用化学处理方法将酶与抗体（或抗原）结合，制成酶标抗体（原），这些酶标记物仍保持其免疫活性，能与相应抗体或抗原特异结合形成酶标记免疫复合物，遇相应底物时，免疫复合物上的酶催化无色的底物，降解生成有色产物或沉淀物，前者可用比色法定量测定，后者可肉眼观察或通过光学显微镜识别。;分子生物学鉴定法;1．双链RNA法（dsRNA）

在受RNA病毒侵染的植物体内，有相应复制形式的双链RNA（dsRNA）存在，而在健康植株中未发现病毒的dsRNA。通过提取纯化待测植物RNA，并对其进行电泳分析，可确定有无dsRNA存在，从而判断待检植物是否带病毒。;2．互补DNA（cDNA检测法）

用互补DNA（cDNA）检测病毒的方法又称DNA分子杂交法。

根据碱基互补原理，人工合成能与病毒碱基互补的DNA（cDNA）即cDNA探针，用cDNA探针与从待检植物中提取的RNA进行DNA－RNA分子杂交，检测有无病毒RNA存在，从而确定植物体内有无该病毒。合成cDNA时，采用同位素标记。因而检测结果可通过放射自显影显示在图像上，直观、准确。;3．聚合酶链式反应PCR

reversetranscriptionPCR,RT-PCR;电镜检测法;五、电镜检测法;谢谢观看