测酶活分析和总结.docx

淀粉酶活力

原理

α－淀粉酶制剂能将淀粉分子链中的α－1，4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮紫色的特性反应逐渐消失，呈现棕红色，其颜色消失的速度与酶活性有关，据此可通过反应后的吸光度计算酶活力。

试剂和溶液

碘

碘化钾

原碘液

称取11.0和22.0化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，贮存于棕色瓶中。

稀碘液

吸取原碘液2.00mL，加20.0g钾用水溶解并定容至500mL，贮存于棕色瓶中。

可溶性淀粉溶液（20g/L）

称取2.000g（精确至0.001g）可溶性淀粉（以绝干计）于烧杯中,用水调成浆状物，边搅拌边加入沸水90mL，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100mL。溶液现配现用。

注：可溶性淀粉应采用浙江菱湖食品化工联合公司（湖州展望化学药业有限

公司）生产的酶制剂专用可溶性淀粉。

磷酸缓冲液（pH＝6.0）

称取45.23g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和8.07g柠檬酸（C6H8O7·H2O），用水溶解并定容至1000mL。用pH计校正后使用。

盐酸溶液c（HCl）=0.1mol/L：按GB/T601配制

仪器和设备

除实验室常规仪器外还有：

分光光度计

恒温水浴

秒表

试管25mm×200mm。

分析步骤

待测酶液的制备

称取1g～2g酶粉（精确至0.0001g）或准确吸取酶液1.00mL，用少量磷酸缓冲液（6.3.2.6）充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液（6.3.2.6）充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用缓冲液

（6.3.2.6）定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。

注：待测中温α－淀粉酶酶液酶活力控制酶浓度在3.4-4.5u/ml范围内，待测耐高温α－淀粉酶活力控制酶浓度在60-65u/ml范围内。

测定

吸取20.0mL可溶性淀粉溶液（6.3.2.5）于试管（6.3.3.4）中，加入磷酸缓冲液（6.3.2.6）5.00mL，摇匀后，于60℃±0.2℃（耐高温α－淀粉酶制剂70℃

±0.2℃）恒温水浴中预热5min。

加入1.00mL稀释好的待测酶液（6.3.4.1），立即计时，摇匀，准确反应5min。立即用自动移液器吸取1.00mL反应液，加到预先盛有0.5mL盐酸溶液

（6.3.2.7）和5.00mL稀碘液（6.3.2.4）的试管中，摇匀，并以0.5mL盐酸溶液和5.00mL稀碘液为空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度（A）。根据吸光度查表C1，求得测试酶液的酶活力。

计算

α－淀粉酶制剂的酶活力按式（1）计算：

X1＝c×n （1）GB××××—××××

其中：

X1——样品的酶活力，单位为u/mL或u/g；c——测试酶液的酶活力（浓度），单位为u/mL或u/g；n——样品的稀释倍数。

所得结果表示至整数。

耐高温α－淀粉酶制剂的酶活力按式（2）计算：

X2＝c×n×16.67 （2）

其中：

X2——样品的酶活力，单位为u/mL或u/g；c——测试酶液的酶活力（浓度），单位为u/mL或u/g；n——样品的稀释倍数;16.67——根据酶活力定义计算的换算系数。

所得结果表示至整数。

甘露聚糖酶活测定（参照国际标准）

甘露聚糖酶活力单位定义

在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖（SigmaG0753）溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。

测定原理

甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。

标准曲线的绘制

吸取乙酸-乙酸钠缓冲液4.0ml，加入DNS试剂5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。分别吸取甘露糖溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用乙酸-乙酸钠缓冲液定容至100ml，配制成浓度为0.10-0.70mg/mlD-甘露糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml（两个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml水和5mlDNS试剂。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。以甘露糖浓度为