本科分子生物学实验二.ppt

PCR技术及应用基础医学院生物化学教研室一、实验目的1.掌握PCR的概念、原理和反应体系组成。2.熟悉PCR操作的基本过程。3.了解PCR的应用。二、实验的原理（一）概念PCR即聚合酶链反应（polymerasechainreaction），是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106-109倍，从而大大提高对其进行分析研究的速度。三、实验操作（一）PCR过程：1.在冰浴中，按照以下次序将各种成分加入一个无菌0.5ml离心中。PCR反应混合液，老师已经完成，学生只需要取24μl，加DNA模板(1ng/μl)1μl，总体积25μl，稍加离心混匀。2.设定反应程序，将上述混合液置PCR仪中进行扩增。扩增条件为：93℃预变性2min93℃30s→58℃30s→72℃30s循环20－25次最后在72℃，保温5min(PCR产物大小为289bp)（二）酶切产物和PCR产物鉴定1.琼脂糖凝胶电泳：向加入核酸染料琼脂糖凝胶的1-2孔分别加入大小DNAmarker5μl；3-5孔分别加入未酶切的空载体、酶切空载体和未酶切的重组体10μl；以后每组同学分别加入酶切重组体和PCR产物10μl。上样完成后，100V电泳，20-30分钟。2.紫外透视仪观察。DNA存在处显示出绿色的荧光条带。四、结果分析五、思考题1.PCR的概念和原理。2.PCR的衍生技术。**5?Primer15?Primer2Cycle2Cycle15?5?5?5?5?5?TemplateDNA5?5?5?5?5?5?5?5?（二）基本工作原理Cycle35?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?5?25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+（三）PCR体系基本组成成分（四）PCR的基本反应步骤变性95?C延伸72?C退火Tm-5?C（五）PCR的主要用途1.目的基因的克隆利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获得已知的目的基因；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的DNA片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。2.基因的体外突变采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。3.DNA和RNA的微量分析由于PCR技术具有高度敏感性，故可用于微量DNA和RNA的分析检测。4.DNA序列测定5.基因突变分析