微生物实验室基础操作详细指导.docx

微生物实验室基础操作详细指导

一、微生物无菌室基本要求及管理

1.1无菌室的基本建设要求

1.1.1根据本实验室所涉及的生物安全等级，无菌室的设计和建设应符合GB50364和GB19489的相关要求。

1.1.2无菌室大小应能够满足检验工作的需要，内墙为浅色，地面和地面应光滑，墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，无死角，易于清洁和消毒。

1.1.3无菌室入口处应设置缓冲间，缓冲间内应安装非手动式开关的洗手盆，并可有毛巾。缓冲间应有足够的面积以保证操作人员更换工作服及鞋帽。

1.1.4无菌室内工作台的高度约80cm,工作台应保持水平，工作台二应无渗漏，耐腐蚀，易于清洁、消毒。

1.1.5无菌室内光照应分布均匀，工作台面的光照度应不低于540Ix。

1.1.6无菌室应具备适当的通风和温度调节的条件。无菌室的推荐温度为20℃，相对湿度为40%~60%。

1.1.7缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置。

1.2无菌室的管理

1.2.1无菌室在使用前和使用后应进行有效的消毒。

1.2.2无菌室的灭菌效果应至少每两周验证一次。

1.2.3应制定清洁、消毒、灭菌、使用和应急处理程序。

1.2.4应记录环境检测结果，并归档保存。

1.2.5不符合规定时应立即停止使用

1.3微生物实验室消毒处理方法

1.3.1无菌室

1.3.1.1紫外线消毒

（1）在室温20C~25℃时，220V30W紫外灯下方垂直位置1.0m处的253.7nm紫外线辐射强度应70W/cm2,低于此值时应更换，适当数量的紫外灯，确保平均每立方米应不少于1.5W。

（2）紫外线消毒时，无菌室内应保持清洁干燥。

（3）在无人条件下，可采取紫外线消毒，作用时间应30min,室内湿度20%或40%、相对湿度大于60%时，应适当延长照射时间。

（4）用紫外线消毒物品表面时，应使照射表面受到紫外线的直接照射，且应达到足够的照射剂量。

（5）人员在关闭紫外灯至少30min后方可入内作业。

（6）按照GB15981的规定，评价紫外线的消毒与杀菌效果。

1.3.1.2臭氧消毒

（1）封闭无菌室内，无人条件下，采用20mg/m3浓度的臭氧,作用时间应30min。消毒后室内臭氧浓度0.2mg/m3时方可入内作业。

（2）按照GB/T18202的规定，检测室内臭氧的浓度。

1.3.1.3无菌室空气灭菌效果验证方法(沉降法)

（1）在消毒处理后与开展检验活动之前期间采样。

（2）取样点的选择应基于人员流量情况和做试验的频率。一般情况下，无菌室面积30m2时，从所设定的条对角线选取3点，即中心1点，两端各距离墙1m处各取1点；无菌室面积30m2时，选取东西北中5点，其中东点、南点、西点、北点均距离墙lm.

1.3.2生产环境卫生指标:

装配与包装车间空气中细菌菌落总数应≤2500CFU/m3

工作台表面细菌菌落总数应≤20CFU/cm2

工人手表面细菌菌落总数应≤300CFU/只手，并不得检出致病菌。

二、样品的准备

食品生产线每两小时取样1次，异常停机时再取一次。每天取样12瓶，然后在12瓶中随机抽取3瓶做微生物检测。

做微生物之前，在缓冲间用75%的酒精对样品外表进行杀菌。之后送到传递窗口处。避免样品对无菌间造成二次污染。

2.1工作台面与工人手表面采样与测试方法

2.1.1样品采集

工作台:将经灭菌的内径为5cm*5cm的灭菌规格板放在被检物体表面，用以浸有灭菌生理盐水的棉签在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。

工人手:被检人五指并拢，用以浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。

2.1.2细菌菌落总数检测

将已采集的样品在6h内送实验室，每支采样管充分混匀后取1mL样液，放入灭菌平皿内，倾注营养琼脂培养基，每个样品平行接种两个平皿，置35℃土2℃培养48h,计数平板上细菌菌落数。

2.2空气采样与测试方法

2.2.1样品采集

在动态下进行。

室内面积不超过30m3，在对角线上设里中外三点:里、外点位置距墙1m;室内面积超过30m3,设东西南北中5点，周围4点距墙1m。采样时，将含营养琼脂培养基的平板(真径9cm)置采样点(约桌面高度)，打开平皿盖，使平板在空气中暴露5min。

2.2.2细菌培养

在采样前将准备好的营养琼脂培养基置35℃土2℃培养24h,取出检查有无污染，将污染培养基剔除。

将已采集的培养基在6h内送实验室，于35℃土2℃培养48h,观察结果，计数平板上细菌菌落数。

三、培养基与试剂制备的制备和杀菌

3.1试剂的配制

3.1.1无菌生理盐水的配制

用精确到0.01g的电子称称取8.5g微