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纤维素酶活的测定
—纤维素酶活力单位定义
在37℃、pH值为5.50的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
二测定原理
纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原集团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应,反应颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比。因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中的纤维素酶的活力。
三试剂与溶液
除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水。
葡萄糖溶液,c(C6H12O6)=10.0mg/ml
称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml。
乙酸溶液,c(CH3COOH)=0.1mol/L
吸取冰乙酸0.60ml,加水溶解,定容至100ml。
乙酸钠溶液,c(CH3COONa)=0.1mol/L
称取三水乙酸钠1.36g,加水溶解,定容至100ml。
氢氧化钠溶液,c(NaOH)=200g/L
称取氢氧化钠20.0g,加水溶解,定容至100ml。
乙酸-乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH-CH3COONa)
称取三水乙酸钠11.57g,加入冰醋酸0.85ml,加水溶解,定容至1000ml,测定溶液的pH值,如果pH偏离5.50,用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调至5.50.
羧甲基纤维素钠溶液,0.8%(w/v)
称取羧甲基纤维素钠(SigmaC5678)0.40g,加入到盛有30ml3.5缓冲溶液的烧杯中,磁力搅拌,同时缓慢加热,直至羧甲基纤维素钠完全溶解(在搅拌加热过程中可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过50ml),停止搅拌,用3.5缓溶将其定容至50ml,羧甲基纤维素钠溶液能立即使用,使用前适当摇匀。4℃避光保存,有效期为3天。
DNS试剂
称取3,5-二硝基水杨酸(化学纯)3.15g,加水500ml,搅拌5min,水浴至45℃,然后逐步加入100ml氢氧化钠溶液(3.4),同时不断搅拌,知道溶液清澈透明(在加入氢氧化钠过程中,溶液温度不要超过48℃).再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g,继续45℃水浴加热,同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解,停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml,用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液,储存在棕色试剂瓶中,避光保存,室温下可以存放7天后可以使用,有效期为6个月。
四仪器与设备
实验室用样品粉碎机或碾钵。
分样筛:口径为0.25mm(60目)。
分析天平:精确至0.001g。
pH计:精确至0.01.
磁力搅拌器:附加热功能。
振荡器
烧结玻璃过滤器:孔径为0.45nm。
离心机:2000r/min以上。
恒温水浴锅:温度控制范围在30-60℃之间,精度为0.1℃.
五标准曲线的绘制
标准空白样:吸取3.5缓冲液4.0ml,加入DNS试剂5.0ml,震荡后沸水浴加热5min,然后迅速用冷水冷却至室温,用水定容至25.00ml,震荡摇匀。
葡萄糖:分别吸取葡萄糖溶液(3.1)1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00ml,分别用3.5缓溶定容至
100ml,配制成浓度为0.10-0.70mg/ml的葡萄糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00ml(分别做2个平行),分别加入到7个试管中,再分别加入2ml蒸馏水和5mlDNS试剂,震荡均匀后沸水浴加热5min,然后迅速用冷水冷却至室温,用水定容至25.00ml,震荡摇匀。
以标准空白样作为对照调零,在540nm处测定吸光值。
以葡萄糖浓度为Y轴,吸光度OD值为X轴,绘制标准曲线,每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲
线。
六测定步骤
反应顺序样品、标准样品空白溶液2ml
反应顺序
样品、标准
样品空白
溶液2ml
5ml
素钠
反应结束后,在室温下静置10min进行比色
1、加入待反应酶液
2ml
2ml
2、依次加入 底物羧甲基纤维素钠
3、充分混合均匀 √
DNS试剂
√
4、依次加入
5、充分混合均匀
--
--
底物羧甲基纤维
溶液2ml
√
6、37℃水解30min(时间要精确)
√
√
7、依次加入
DNS试剂5ml
--
8、充分混合均匀
√
--
9、沸水浴5min
√
√
10、冷水快速降温
√
√
11、总体积定容
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