荧光定量pcr技术专题.ppt

荧光定量PCR技术讲座;内容概要;实时定量PCR技术：

运用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一种循环扩增产物量的变化，通过Ct值和原则曲线的关系对起始模板进行定量分析;扩增曲线

荧光阈值

Ct值;Cycle（循环数）;Cycle（循环数）;Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号到达设定的阈值时所通过的扩增循环次数;理想的PCR反应;非理想的PCR反应;在扩增产物到达荧光阈值时;Cyclenumber;线性关系、扩增效率确认;内容概要;非特异性荧光标识

SYBRGreenI

特异性荧光标识

TaqManProbe;;热变性;问题点：

SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如

果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将

同步被检测，从而也许导致检测成果不精确。;将温度与荧光强度的变化求导(-dI/dT);;使用以便，不必设计复杂

探针

具有价格优势;Taqman探针法——原理;Taqman探针法——工作机理;1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70℃，30bp,5’不能有G，G也许会淬灭荧光素，

引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃

2、反应参数确实定：