双抗原夹心ELISA方法检测艾滋病病毒抗体标准操作规程.pdfVIP

八五三农场职工医院检验科文件编号：BWS-07-01-001

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第3版第0次修订

文件名称：双抗原夹心ELISA方法检测艾滋病病毒抗体标准操作规程实施日期：20**-7-11

双抗原夹心ELISA方法检测艾滋病病毒抗体标准操作规程

1、目的

规范抗-HIV抗体检测操作程序。

2、适用范围

本实施细则使用于对人类血清或血浆中艾滋病毒抗体的初筛检测。

3、原理

采用夹心ELISA方法检测血清或血浆样品中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2型）抗体，预

包被高纯度重组HIV（1+2型）抗原，待检血清中的抗HIV抗体与包被抗原反应，再与酶

标HIV-1+2型抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，加底物（TMB）显色，在酶标

仪上测定OD值，根据OD值判定有无HIV抗体的存在。

4、环境条件

室温18-25℃。室内相对湿度30-60％

5、试剂与材料

5.1、吸水纸；

5.2、说明书1份；

5.3、HIV抗原包被板1块，每板12条，每条8孔；

5.4、HIV酶标抗原工作液1瓶；

5.5、50倍浓缩洗液1瓶；

5.6、HIV阳性对照（已灭活）1支；

5.7、HIV阴性对照1支；

5.8、底物液A1瓶；

5.9、底物液B1瓶；

5.10、终止液1瓶；

5.11、封口胶2张；

5.12、塑料袋1个；

5.13、（新鲜）蒸馏水或去离子水；

5.14、一次性V型水槽；

5.15、一次性瓶（塑料），用于准备TMB底物液；

5.16、一次性乳胶手套；

5.17、记时器；

5.18、5％次氯酸钠或其他认可消毒液；

5.19、适用盛装有可能受污染的物品的容器；

5.20、尿过氧化物溶液2瓶，每瓶11ml。

6、仪器

6.1、酶标仪；

6.2、水浴箱（35-39℃）；

6.3、离心机；

6.4、洗板机；

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6.5、打印机。

7、操作步骤

7.1、使用前将试剂盒从冰箱中取出平衡至室温，取出所须板条，剩余的及时封存放回冰

箱。

7.2、每次实验均须设立空白对照孔2孔，不加样品和酶结合物，只加底物和终止液；抗-

HIV阳性对照孔3孔，每孔50或100μl。

7.3、其余各孔加待检测标本50或100μl。

7.4、覆盖粘胶纸，置37℃孵育30或60分钟。

7.5、将50倍浓缩洗液用纯化水50倍稀释后备用。

7.6、取出已孵育完毕的反应板，弃去粘胶纸，放入洗板机中，吸干板内液体，将洗涤液注

满酶孔（约300μl/孔），吸干，反复5次，在干净纱布上将板拍干。

7.7、除空白孔外，每空加入酶标抗原工作液50或100μl，贴上封口胶。37℃温育20或

30分钟。

7.8、洗涤同步骤7.6。

7.9、每孔加入底物缓冲液A50μl、TMBB50μl，混匀，置37℃显色10分钟。

7.10、加终止液50μl振荡反应板5秒种，使之充分混匀。

7.11、在酶标读数仪中，取波长450nm（建议使用双波长酶标仪比色，参考波长630nm），

以空白对照孔校零，读取每孔吸收值（加终止液后，务必在15分钟内读数完毕）。

8、质量控制与评价

8.1、抗HIV阳性对照OD值＞0.8，抗HIV阴性对照OD值＜0.08或0.12。

8.2、阳性对照OD值有效范围：≥0.50。