生鲜肉中3种食源性致病菌Taqman多重荧光定量PCR检测方法的建立.pptxVIP

生鲜肉中3种食源性致病菌Taqman多重荧光定量PCR检测方法的建立汇报人：2024-02-05

目录CONTENTS引言材料与方法结果与分析讨论结论与展望附件

01引言

食源性致病菌对公共卫生的威胁食源性致病菌是引起食物中毒和食源性疾病的主要原因，对公共卫生安全构成严重威胁。传统检测方法的不足传统微生物检测方法存在操作繁琐、耗时长、灵敏度不足等问题，难以满足快速、准确检测的需求。Taqman多重荧光定量PCR技术的优势Taqman多重荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、可定量等优点，适用于多种食源性致病菌的同时检测。研究背景与意义

国外研究现状国内研究现状发展趋势国内外研究现状及发展趋势国外在食源性致病菌的Taqman多重荧光定量PCR检测方面已有较多研究，建立了多种多重PCR检测方法，并应用于实际样品检测。国内在该领域的研究起步较晚，但近年来发展迅速，已有多家单位开展了相关研究，并取得了一定成果。随着分子生物学技术的不断发展，Taqman多重荧光定量PCR技术将在食源性致病菌检测领域发挥越来越重要的作用，未来有望实现更高通量、更快速、更准确的检测。

研究内容技术路线研究内容与技术路线首先收集3种食源性致病菌的标准菌株和生鲜肉样品，提取DNA作为模板；然后设计并合成特异性引物和探针，建立Taqman多重荧光定量PCR反应体系；接着对反应条件进行优化，确定最佳反应条件；最后对建立的检测方法进行特异性、灵敏度和实际应用效果的评价。本研究旨在建立一种针对生鲜肉中3种常见食源性致病菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌）的Taqman多重荧光定量PCR检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度和实际应用效果进行评价。

02材料与方法

采集自当地市场，包括猪肉、牛肉、羊肉等，确保样品新鲜且无腐败迹象。生鲜肉样品包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7，均购自权威微生物菌种保藏中心。食源性致病菌菌株实验材料

荧光定量PCR仪、高速冷冻离心机、生物安全柜、恒温培养箱等。Taqman探针及引物、PCR反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶等，均购自知名生物科技公司。实验仪器与试剂试剂仪器

Taqman多重荧光定量PCR方法建立引物与探针设计针对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的特异性基因序列，设计相应的引物和Taqman探针。PCR反应体系优化通过调整引物、探针浓度及PCR反应条件，建立最佳的多重荧光定量PCR反应体系。标准曲线绘制将已知浓度的食源性致病菌DNA作为模板，进行PCR扩增并绘制标准曲线，以评估方法的准确性和灵敏度。异性验证灵敏度验证重复性验证实际应用验证方法学验证选取非目标菌株及其他常见微生物，进行PCR扩增以验证方法的特异性。将食源性致病菌DNA进行梯度稀释，进行PCR扩增以评估方法的灵敏度。将建立的多重荧光定量PCR方法应用于实际生鲜肉样品中食源性致病菌的检测，以评估方法的实用性和可靠性。选取不同批次的生鲜肉样品，进行PCR扩增以评估方法的重复性。

03结果与分析

123针对3种食源性致病菌的特异性基因序列，设计合成特异性引物和探针，确保检测方法的高特异性。特异性引物和探针设计分别使用3种食源性致病菌的单一菌种进行PCR扩增，结果显示各菌种均能特异性扩增出目标片段，无非特异性扩增。单一菌种验证将3种食源性致病菌的混合菌种进行PCR扩增，结果显示各菌种的目标片段均能被特异性扩增，无交叉反应。混合菌种验证Taqman多重荧光定量PCR方法特异性验证

标准品制备通过对不同浓度的标准品进行PCR扩增，确定该方法的最低检测限，结果显示该方法对3种食源性致病菌的最低检测限均达到较低水平。最低检测限确定重复性验证对同一浓度的标准品进行多次PCR扩增，结果显示该方法的重复性良好，稳定可靠。制备3种食源性致病菌的标准品，并进行梯度稀释，用于后续灵敏度验证。Taqman多重荧光定量PCR方法灵敏度验证

样品处理与DNA提取01采集不同来源的生鲜肉样品，进行前处理并提取DNA，用于后续PCR扩增。实际样品检测02将提取的DNA作为模板进行PCR扩增，结果显示部分样品中检测到目标致病菌的存在。结果分析03对检测结果进行统计分析，评估该方法在实际样品检测中的应用效果和价值。同时，对检测出的阳性样品进行进一步确认和溯源分析，为食品安全监管提供有力支持。实际样品检测结果与分析

04讨论

优势Taqman多重荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、可定量等优点，能够同时检测多种食源性致病菌，提高检测效率。局限性该方法需要昂贵的仪器设备和专业的操作人员，成本较高；同时，对于某些难以提取的DNA样本，可能会出现假阴性结果。Taqman多重荧光定量PCR方法优势与局限性

与其他检测方法的比较与