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real-time-PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价

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Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。现在有TaqmanMGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。

3．探针的名称

应标记探针在基因组的位置及长度。

4．探针Tm值计算

用oligo或primerpreiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。

5．探针的评价

用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“createprimercatalog”，在“name”中输入探针的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primerselfdimer”,分析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dimer，并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primerhairpins”,分析探针的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins，并对此探针的hairpins进行评价。多重荧光PCR时，要对多条探针进行“pairdimer”进行分析。

6．探针的5’端不能为G因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。

7．Taqman探针与引物之间的位置

Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠，要保证Taqman探针的5’端离上游引物的5’端至少有4bp。

如：?forwardprimerTaqmanprobe

5’→3’5’FAM→3’染料

NNNNNNNNNNNNNN

发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

互补发表序列3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’

NNNNNNN

3’←5’

reverseprimer

或：

reverseprimer

5’→3’

NNNNNNN

发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

互补发表序列3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’

NNNNNNNNNNNNNN

料染3’←MAF5’3’←5’

Taqmanprobeforwardprimer

Taqmanprobeforwardprimer

然后探针用同一染料标记，这样在实时PCR反应中，虽然是多重PCR反应，但报告却是同一个染料报告。

三引物的设计

1．上下游引物要保守

为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守，最好不要有不同的碱基，若不得不有时，也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。

在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序列的5’端引物位置找的是3’端至少有5个bp保守，在即在发表序列的3’端引物位置找的是5’端至少有5个bp保守。

5’NNNNNNN3’

发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’NNNNNNNNN5’

2．上下游引物的长度和Tm值

上下游引物的长度一般为18-25bp之间，且Tm值在58-60℃之间。确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。

上游引物应标记F(forword)，且在基因组的位置及长度；下游引物应标记R(reverse)，且在基因组的位置及长度。用oligo或primerpreiemer软件即可计算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃