核酸提取常见试剂的作用原理.pdfVIP

创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日

异硫氰酸胍之答禄夫天创作

创作时间：贰零贰壹年柒月贰叁拾日

强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破

碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐是

破坏蛋白质三维结构的离液剂，在通常使用的蛋白质变性剂中作用

最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲

状态。含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。

在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如

SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。

盐酸胍、尿素

盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，它其实不是一种足够强的变

性剂，可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来。

4-8M可断裂氢键，有两种可能机制：1变性蛋白和盐酸胍、尿

素优先结合，形成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，从

而引起N-D反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的

蛋白不竭转变成复合物，最终导致蛋白质完全变性；2盐酸胍、尿

素对氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢

键结构，结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂，使蛋白

质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿素引起的变性往

往是不成逆的。

高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性

十二烷基肌氨酸钠

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使蛋白质解体变性

巯基试剂

1防止蛋白质或酶等（如辅酶A）分子中SH基团氧化成二硫键，

2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。DTT，DDTE、巯基乙

醇应用最广，谷胱甘肽也常应用，由于他是生物体内的还原剂，同

时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。DNA提取中，常使用巯基

乙醇，维持缓冲液的还原环境，防止多酚类氧化，由于具有一定的

毒性，浓度不该高于2%。

巯基乙醇

β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键（肽和蛋

白质分子中的半胱氨酸残基中的键）。

1还原蛋白质二硫键，使Rna酶变性

2抑制酚类氧化，若氧化，核酸会酿成灰黑色，苯酚的氧化产品苯

醌等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联

3呵护蛋白质的巯基蛋白质提取中需要

巯基乙醇还原二硫键，使RNA酶失活

化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德

华力使蛋白质变性但不影响肽键和二硫键，不克不及使蛋白质完全

变性

加上还原剂巯基乙醇或DTT，能还原二硫键，使RNA完全变性

DTT二硫苏糖醇

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刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基

乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，但DTT价格略高一些。由于

容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差；但冷冻保管或在惰性气

体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低，

随着pH值的降低，DTT的有效还原性也随之降低；DTT或含有DTT

的溶液不克不及进行高压处理。

抑制Rnase活性

TCEP三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐

半胱氨酸

Trizol

苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等。TRIzol的主

要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核

酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不克不及完

全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫

氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。

0.1%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制

作用。

异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白

质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核

酸分离。

β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。

液氮

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组织破碎，裂解细胞

SDS