试验3- 酵母活体染色观察及死亡率的测定.pdfVIP

试验酵母形态的观察及细胞总数、出芽率和死亡率

一、目的要求

1、明确血球计数板计数的原理

2、掌握测定酵母细胞总数、出芽率和死亡率的技术

二、实验原理

镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质

常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则

采用彼得罗夫〃霍泽(PetroffHausser)细菌计数板。两种计数板的原理和

部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，

不能使用油镜，故细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个

方格网。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作

微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而

每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而

每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有

一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成。

每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面

积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，

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所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm，每个小方格的体积为l／4000mm。

使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数

量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。

血球计数扳的构造

血球计数板计数网的分区和分格

三、实验器材

啤酒酵母菌悬液，显微镜，血球计数板，载玻片，电吹风，盖玻片，接

种环，0.1%吕氏美蓝染色液。

四、方法步骤

1、菌悬液的制备

为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含5-10个酵

母宜，可采用10倍系列稀释法。

2、镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。如有污物，则需清洗，用点

吹风吹干后才能进行计数。

3、加样品

将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管将摇匀的菌

悬液由盖玻片边缘让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸

吸去多余菌液。样品要匀充满计数室，不可有气泡。

4、显微镜计数

加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍

物镜寻找计数室的位置，然后换成高倍物镜（40倍）进行计数。显微镜视

野中的光线要暗一些，否则，不容易看清计数室的方格线。计数时，对位于

线上的酵母菌，可采取只计数两条边的办法，即遵循查上不查下，查左不查

右的原则。当酵母菌芽体达到母细胞大小1/2时，即可计作两个细胞。

1ml

5、出芽率的测定

按前法，测定出酵母菌芽体数（小于母细胞1/2的），计算出单位体积

内测得酵母菌细胞的芽体占总数的百分率，即为酵母菌的出芽率。

6、酵母死亡率的测定

滴一滴0.1%吕氏美蓝液于载玻片中央，用接种环取酵母菌液少许，

与染液混匀，染色2–3min，加盖玻片，立即镜检，计数在一个视野中，以

变蓝（死）和未变蓝（活）的细胞数。依法计数2-3个视野中的细胞数。

死细胞数

死亡率=×100%

细胞总数

死亡率是单位体积内死亡的细胞数占总细胞数的百分率。

7、计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完

后自行晾干或电吹风吹干。

五、结果与思考

1、将结果添入下表

次数12平均值

中方格序号

细胞数

芽体数

细