SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告.pdf

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SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量

一、前言

聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支

持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉

双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用

方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催

化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催

化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙

烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，

连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场

作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成

分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不

仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰

度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶

所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7

的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为

pH8.9Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔

径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、

pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

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SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子和

分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强

还原剂如巯基乙醇，二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在

样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的

氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了

蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差

异。

SDS一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，

能够有较高的分辨率。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀

的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭

窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/

甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨

酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，

甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过

蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因

而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳

定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。

此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，

而与所带电荷和分子形状无关。

聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理

聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式:

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非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶

(SDS);非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够

保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附

带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

而SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白

质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和

丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基硫酸钠)

后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽

略电荷因素)。

二、实验目的

1.学习SDS测定蛋白质分子量的原理。

2.掌握垂直板电泳的操作方法。

3.运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。

三、实验原理

1.电泳

带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。

在一定的电场强度下，分子