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SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量
一、前言
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳,简称PAGE,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支
持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉
双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用
方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催
化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催
化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙
烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,
连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场
作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成
分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不
仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰
度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶
所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7
的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为
pH8.9Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔
径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、
pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。
页脚
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SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子和
分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强
还原剂如巯基乙醇,二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在
样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的
氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束,所带的负电荷大大超过了
蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差
异。
SDS一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,
能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀
的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭
窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液,电极液选TRIS/
甘氨酸。电泳开始后,HCl解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨
酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,
甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过
蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因
而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成一稳
定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。
此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,
而与所带电荷和分子形状无关。
聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式:
页脚
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非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶
(SDS);非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够
保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附
带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白
质。该技术最初由shapiro于1967年建立,他们发现在样品介质和
丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基硫酸钠)
后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽
略电荷因素)。
二、实验目的
1.学习SDS测定蛋白质分子量的原理。
2.掌握垂直板电泳的操作方法。
3.运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。
三、实验原理
1.电泳
带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。
在一定的电场强度下,分子
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