重组DNA技术讲解专家讲座.pptxVIP

重组DNA技术

RecombinantDNATechnology;重组DNA技术（recombinantDNAtechnology）

又称分子克隆（molecularcloning）或DNA克隆（DNAcloning）或基因克隆（genecloning)技术，是指在体外利用酶学方法将目标DNA片段与能自主复制遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而取得单一DNA分子大量拷贝。

;第一节

重组DNA技术中惯用

工具酶

FrequentlyUsedEnzymesinRecombinantDNATechnology

;重组DNA技术中惯用工具酶;一、限制性核酸内切酶用于切割DNA;第一个字母取自产生该酶细菌属名，用大写斜体；

第二、第三个字母是该细菌种名，用小写斜体；

第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；

用罗马数字表示发觉先后次序。;（二）Ⅱ型限制性内切酶含有一些共性和特征;2.识别核苷酸序列通常为回文结构（palindrome）;BamHⅠ;同尾酶（isocaudarner）

有些限制性内切酶即使识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同黏端，这么酶彼此互称为同尾酶。这两个相同黏端称为配伍末端(compatibleend)。;GGATCC

CCTAGG;6.切割会受其它原因影响

限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化序列。

缓冲液或环境温度也会影响一些酶特异性。比如，EcoRI在正常情况下识别“-GAATTC-”序列，但在甘油浓度大于5%（v/v）或反应温度较低时识别序列可变为“-AATT-”或“-嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活性（staractivity），以EcoRI*表示。;二、DNA连接酶用于催化DNA片段连接;

1.大肠杆菌染色体编码DNA连接酶

需NAD+作为辅因子

2.大肠杆菌T4噬菌体DNA编码T4DNA连接酶

需ATP作为辅因子

;三、重组DNA技术中还需使用其它惯用工具酶;来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphatase，BAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphatase，CIP）。用于脱去DNA（RNA）5′末端磷酸基团，使5′-P成为5′-OH，该过程称核酸分子脱磷酸作用。;（二）反转录酶以RNA为模板合成cDNA;;大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolymeraseI）是基因工程中惯用DNA聚合酶。其除含有5′→3′聚合酶活性外，还有3′→5′及5′→3′核酸外切酶活性。因其含有5′→3′核酸外切酶活性而惯用于DNA探针缺口平移法（nicktranslation）标识。;DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）裂解后产生大片段，也称为Klenow片段（Klenowfragment）。其保留了5′→3′聚合酶活性及3′→5′外切酶活性，失去了5′→3′外切酶活性。

Klenow片段主要用途有：①补齐双链DNA3′末端，使其转变成平端；或经过补齐3′端而使3′末端标识；②在cDNA克隆中，用于第二股链合成；③用于DNA序列分析。;（六）TaqDNA聚合酶惯用于PCR;（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5′羟基末端磷酸化;第二节

目标DNA获取

PreparationofInterestedDNA;一、化学合成法可直接合成目标DNA?;*化学合成法获取目标DNA;

第一步：构建基因组DNA文库（是指包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列随机克隆群体，以DNA片段形式贮存了全部基因组DNA信息）。

第二步：筛选含有目标基因克隆。;组织或细胞染色体DNA;三、从cDNA文库中获取目标DNA

第一步：构建cDNA文库（包含某一组织细胞在一定条件下所表示全部mRNA经反转录而合成cDNA序列克隆群体，它以cDNA片段形式贮存了全部基因表示信息）。

第二步：筛选含有目标cDNA克隆。

;;从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选目标DNA策略

1.菌落或噬斑原位杂交

2.针对表示文库，可用抗原-抗体或配体-受体结合原理（亲和筛选法）筛选;假如已经知道目标基因序列，就能很方便地用PCR反应，从基因组DNA或cDNA中取得目标基因，可无须要经过复杂DNA文库构建过程。

PCR是一个高效