DOX调控HNRNPK稳定下调的H1299细胞株的构建与研究.pptxVIP

DOX调控HNRNPK稳定下调的H1299细胞株的构建与研究汇报人：2024-01-31

contents目录引言材料与方法DOX调控HNRNPK稳定下调的H1299细胞株的构建下调HNRNPK对H1299细胞生物学特性的影响

contents目录下调HNRNPK在肺癌治疗中的潜在应用价值结论与展望

01引言

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占比超过80%。DOX（Doxorubicin）是一种广谱抗肿瘤药物，但其心脏毒性限制了其临床应用；HNRNPK是一种RNA结合蛋白，参与多种mRNA的加工和翻译过程，与肿瘤的发生发展密切相关。研究DOX调控HNRNPK稳定下调的H1299细胞株，有助于深入了解DOX的作用机制和HNRNPK在肺癌中的功能，为肺癌的治疗提供新的思路和方法。H1299细胞是一种常用的NSCLC细胞系，对研究肺癌的发病机制和治疗策略具有重要意义。研究背景与意义

国内外研究现状及发展趋势目前，国内外已有大量关于DOX和HNRNPK的研究报道，但关于DOX调控HNRNPK的研究相对较少。随着基因编辑技术和高通量测序技术的不断发展，越来越多的研究关注于肿瘤相关基因的功能和调控机制。未来，肺癌的研究将更加注重个体化治疗和精准医疗，基于基因编辑技术和细胞模型的研究将成为重要手段。

输入标究内容与方法构建DOX调控HNRNPK稳定下调的H1299细胞株，利用慢病毒载体将shRNA表达质粒转染至H1299细胞中，通过嘌呤霉素筛选获得稳定转染的细胞株。通过裸鼠成瘤实验观察稳定下调HNRNPK对H1299细胞体内成瘤能力的影响。利用CCK-8、克隆形成、流式细胞术等方法检测细胞增殖、凋亡和周期等生物学特性的变化。通过qRT-PCR和Westernblot等方法检测HNRNPK在mRNA和蛋白水平上的表达变化，验证shRNA的干扰效果。

02材料与方法

123H1299细胞株细胞株DOX（Doxorubicin）、RNA提取试剂、反转录试剂、实时荧光定量PCR试剂等试剂细胞培养箱、生物安全柜、PCR仪、荧光显微镜等仪器实验材料

细胞培养与处理RNA提取与反转录实时荧光定量PCRWesternblot实验方法H1299细胞株的常规培养及DOX处理浓度的筛选检测HNRNPK基因在mRNA水平的表达变化从处理后的细胞中提取总RNA，并反转录成cDNA检测HNRNPK蛋白水平的表达变化

细胞培养→DOX处理→RNA提取→反转录→实时荧光定量PCR→Westernblot实验流程分子生物学技术（RNA提取、反转录、实时荧光定量PCR）→细胞生物学技术（细胞培养、DOX处理）→蛋白质组学技术（Westernblot）技术路线实验流程与技术路线

03DOX调控HNRNPK稳定下调的H1299细胞株的构建

siRNA干扰技术利用小干扰RNA（siRNA）特异性地降解HNRNPK的mRNA，实现基因下调。CRISPR/Cas9基因编辑技术通过设计特异性sgRNA，引导Cas9蛋白对HNRNPK基因进行切割，实现基因敲除或下调。shRNA表达载体构建表达短发夹RNA（shRNA）的载体，转染细胞后持续产生针对HNRNPK的siRNA，实现稳定下调。HNRNPK基因下调策略的选择

Tet-On/Off系统01利用四环素（Tet）或其衍生物如强力霉素（DOX）调控基因表达的系统，通过添加DOX实现HNRNPK基因的下调。Cre/LoxP系统02利用Cre重组酶和LoxP位点特异性重组的特性，构建可诱导的基因下调系统。RNAi诱导表达系统03构建DOX诱导的shRNA或siRNA表达系统，实现HNRNPK基因的可逆下调。DOX诱导基因下调系统的构建

03单克隆细胞株的挑选通过有限稀释法等方法挑选单克隆细胞株，确保基因下调的稳定性和一致性。01转染方法的选择根据实验需求和细胞特性选择合适的转染方法，如脂质体转染、电穿孔转染等。02筛选方法的建立利用抗生素抗性基因、荧光标记基因等筛选标记，建立稳定转染的细胞株筛选方法。H1299细胞株的转染与筛选

通过RT-PCR、Westernblot等方法检测HNRNPK基因在mRNA和蛋白质水平的表达情况，验证基因下调效果。分子生物学鉴定通过细胞增殖、迁移、侵袭等实验验证HNRNPK基因下调对H1299细胞功能的影响。细胞功能学验证通过连续传代培养、冻存复苏等方法验证稳定下调细胞株的遗传稳定性和表型稳定性。稳定性验证稳定下调细胞株的鉴定与验证

04下调HNRNPK对H1299细胞生物学特性的影响

通过MTT法检测下调HNRNPK后H1299细胞的增殖能力，发现细胞增殖受到显著抑制。下调HNRNPK后，H1299细胞的克隆形成能力明显降低