病毒核酸检测标准操作规程荧光法.docVIP

EB病毒（EBV）核酸检测标准操作规程

（荧光PCR法）

1.目的

规范EB病毒核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行EB病毒DNA分析。

2.应用范围

使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒（荧光PCR法）和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。

3.职责

由PCR实验室制定程序文献，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实行。

4.内容

4.1实验原理及其临床应用

本试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反映液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB病毒（EBV）DNA。用于人血中EB病毒DNA的测定，为临床提供参考，

4.2标本采集

4.2.1使用标本类型：全血。

4.2.2标本采集；由合作单位按照以下规定进行采集。

4.2.2.1全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充足混匀，密闭送检。

4.2.3标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。

4.3试剂准备

4.3.1供应商：中山大学达安基因股份有限公司。

4.3.2此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰箱-20℃。

4.3.3假如试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。

4.4质控品

4.4.1质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。

4.4.2质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。

4.4.3质控频度：每次实验均需做质控。

4.5操作过程说明

4.5.1DNA提取

4.5.1.1质控品解决：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。8000rpm离心数秒，吸50ul至0.5ml灭菌离心管中，加入50ulDNA提取液充足混匀，100℃恒温解决10±1分钟；12023rpm离心5分钟，备用。

4.5.1.2样本解决

4.5.1.2.1取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水500ul轻摇混匀；

4.5.1.2.2取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液；

4.5.1.2.3将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁，速度要慢)；

4.5.1.2.42023rpm离心20分钟（建议用水平离心机）；

4.5.1.2.5吸取白细胞层(从上往下第二层)，加入1.5ml离心管，12023rpm离心5分钟；

4.5.1.2.6去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充足混匀，100℃恒温解决10±1分钟；12023rpm离心5分钟，上清备用。

4.5.2.1加样：取PCR反映管若干，加入解决后的样品（标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品）上清液5ul,8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

4.5.3PCR扩增

将准备好的PCR反映管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增反映：37℃-2min；94℃-2min；（94℃-15ses；55℃-45ses）×40cyclics；

EBV检测荧光素：FAM;反映体系：50ul；荧光信号收集：55℃-45ses，末端收集。

4.5.3Mx3000P荧光定量PCR仪的设立及结果分析

4.5.3.1打开计算机电源。

4.5.3.2将Mx3000P电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。打开电脑上的Mx3000P软件，拟定软件界面右下面的联机标志呈现绿色。假如不是绿色而是红色，软件会提醒，这时只需要继续稍等半晌，待仪器自检完毕，会自动连接计算机。

4.5.3.3在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型，通常选择第一项“QuantitivePCR（MultipleStandards）”进行绝对定量分析。

4.5.3.4拟定卤钨灯已经打开。(绿色)则说明卤钨灯已经打开；（黄色）则说明卤钨灯正在预热；（红色）则说明卤钨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这个标志将光源打开。在卤钨灯已经被打开的情况下，软件界面右下方会显示（绿色）。

4.5.3.5最佳在仪器与光源预热20分钟后开始实验。

4.5.3.6在里，对所选孔进行设定，在Welltype中设定Standard（标准品）、NTC（阴性对照）、unkown（样品）等，并选择对的的荧光通道（FAM,HEX,ROX，Cy5），参比荧光（Referencedye）选