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HER2基因扩增检测（dPCR法）的操作规范与质控标准

一、检测实验室总体要求

开展HER2基因扩增检测试剂盒（dPCR法）检测HER2基因扩增的实验室应符合中国国家卫生健康委员会《临床基因扩增检验实验室工作规范》，原则上dPCR临床检测实验室应分为3个隔开的工作区域：①试剂贮存和准备区，②标本制备区，③dPCR扩增区和扩增产物分析区。每一区域都应有专用的仪器设备。与上述特定实验区有关的各个房间及设备物品必须有明确的标识，以避免不同工作区内的设备物品，如加样器、试剂等的移出或不同的工作区间发生混淆。进入各个工作区必须按单一方向进行，即从试剂贮存和准备区到标本制备区再到dPCR扩增区和扩增产物分析区。实验室各区应制定相应标准操作规程和严格的质控文件。由省级临床基因扩增实验室验收合格的实验室方可进行试验。

二、?检测流程及操作规范

HER2基因扩增检测试剂盒（dPCR法）适用于HER2基因扩增的检测，其检测过程分为样本采集、核酸纯化及定量、dPCR检测和出具报告4个阶段。用户需根据产品使用说明书针对整个操作流程形成标准操作流程（standardoperationprocedure，SOP）并对SOP进行验证，验证后对操作人员进行培训后方可开展检测。

1、样本采集、保存及转运

甲醛溶液固定、石蜡包埋组织样本要求肿瘤含量不低于10%，需采用4%甲醛溶液固定，严格按照《临床技术操作规范病理学分册》进行石蜡包埋。每例样本切5~10μm的切片10张，其中1张切片用于确定肿瘤组织样本中肿瘤细胞比例，可采用临床常用方法；余下的1~9张切片用于提取样本DNA。切片及刮取肿瘤组织过程中，要避免不同病例组织间的交叉污染。

外周血样本由于常规采血管中cfDNA的半衰期仅2h，需使用PAXgeneBloodccfDNATube（德国Qiagen公司）以保持cfDNA的稳定。按使用说明书采集血样，采集到血样之后立即轻轻翻转采血管混合8~10次。常温条件下可以保存5d。

2、核酸纯化

核酸纯化和定量应使用厂家使用说明书中推荐的、经临床验证的产品，以保证提取到的核酸的纯度及稳定性。纯化及定量过程因样品量而异，通常为2~3h。已纯化的核酸建议当天进行定量和检测，避免冻融。若核酸浓度较低，需浓缩后再行dPCR检测。剩余核酸应在-20℃保存。

3、dPCR检测

芯片式dPCR检测包括检测反应液的配制，上样至dPCR芯片上并密封。PCR过程在平板式PCR扩增仪上完成，扩增时间约3h。完成扩增的样品在芯片阅读仪上读取结果。

核酸样本的起始用量对于检测结果的准确性和可靠性至关重要。在使用HER2基因扩增检测试剂盒（dPCR法）检测时，应使每个微孔中只获得单个模板分子。故以5ngDNA为核酸用量为佳，在此上样量下，目标区域的拷贝数在200~2000拷贝/μL的范围内，这是dPCR定量精密度和准确度最高的区域。对于组织样本检测结果，当HER2基因拷贝数/内参基因拷贝数比值＞1.8时，为HER2基因扩增（HER2检测阳性）；对于外周血样本检测结果，当HER2基因拷贝数/内参基因拷贝数比值1.3时，为HER2基因扩增（HER2检测阳性）。

4、检测结果分析报告

检测过程中应使用HER2基因扩增检测试剂盒（dPCR法）中的阳性和阴性质控品作为试剂盒性能验证和操作流程的质控手段，以确保试剂满足检测要求及检测过程的规范。

针对HER2基因扩增检测试剂盒（dPCR法）检测有对应的软件实现阈值自动划分、结果自动判读，避免人工判读带来的偏差，保证结果的客观性和一致性。分析软件还包括严格的内部质控条件，避免由于实验操作或上样量过低造成的结果偏差，可很好地保证临床试验样本数据分析的精密度和准确度，满足实验人员直接上传数据、下载检测报告的需求。

检测报告单的内容应包括但不限于：

①患者基本信息：如患者姓名、性别、年龄、临床诊断信息等；②样本信息：样本来源与类型、接收时间、报告时间等；③检测信息：如检测项目与位点、检测技术和质控信息等；④检测结果：样本识别号、检测基因名称及被检测的变异类型（如HER2基因扩增）、检测结果（动态监测结果为检测信号比值，伴随诊断检测结果为阴性或阳性）；⑤检测方法的局限性：检测方法在样本检测中存在的局限性或不确定结果的可能性。

3、质控标准

HER2基因扩增检测试剂盒（dPCR法）用于检测甲醛溶液固定、石蜡包埋组织样本及外周血血浆样本中HER2的扩增状态。质控标准如下：

⑴甲醛溶液固定、石蜡包埋组织样本的肿瘤含量需大于10%。纯化并定量的基因组DNA浓度不低于1ng/μL；

⑵外周血样品不得有溶血，或在PAXgeneBloodccfDNATube中保存时间超过7d。纯化并定量的游离DNA浓度不低于1ng/μL；

⑶检测过程中