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GATK使用方法详解-plob最详尽说明书
1.对原始下机fastq文件进行过滤和比对(mapping)
对于Illumina下机数据推荐使用bwa进行mapping。
Bwa比对步骤大致如下:
(1)对参考基因组构建索引:
例子:bwaindex-abwtswhg19.fa。
构建索引时需要注意的问题:bwa构建索引有两种算法,两种算法都是基于BWT的,这两种算法通过参数-ais和-abwtsw进行选择。其中-abwtsw对于短的参考序列是不工作的,必须要大于等于10Mb;-ais是默认参数,这个参数不适用于大的参考序列,必须要小于等于2G。
(2)寻找输入reads文件的SA坐标。
对于pairend数据,每个reads文件单独做运算,singleend数据就不用说了,只有一个文件。
pairend:
bwaalnhg19.faread1.fq.gz-t4-Iread1.fq.gz.sai
bwaalnhg19.faread2.fq.gz-t4-Iread2.fq.gz.sai
singleend:
bwaalnhg19.faread.fq.gz-l30-k2-t4-Iread.fq.gz.sai
主要参数说明:
-oint:允许出现的最大gap数。
-eint:每个gap允许的最大长度。
-dint:不允许在3’端出现大于多少bp的deletion。
-iint:不允许在reads两端出现大于多少bp的indel。
-lint:Read前多少个碱基作为seed,如果设置的seed大于read长度,将无法继续,最好设置在25-35,与-k2配合使用。
-kint:在seed中的最大编辑距离,使用默认2,与-l配合使用。
-tint:要使用的线程数。
-Rint:此参数只应用于pairend中,当没有出现大于此值的最佳比对结果时,将会降低标准再次进行比对。增加这个值可以提高配对比对的准确率,但是同时会消耗更长的时间,默认是32。
-Iint:表示输入的文件格式为Illumina1.3+数据格式。
-Bint:设置标记序列。从5’端开始多少个碱基作为标记序列,当-B为正值时,在比对之前会将每个read的标记序列剪切,并将此标记序列表示在BCSAM标签里,对于pairend数据,两端的标记序列会被连接。
-b:指定输入格式为bam格式。这是一个很奇怪的功能,就是对其它软件的bam文件进行重新比对的意思
bwaalnhg19.faread.bamread.fq.gz.sai
(3)生成sam格式的比对文件。如果一条read比对到多个位置,会随机选择一种。
例子:singleend:
bwasamsehg19.faread.fq.gz.sairead.fq.gzread.fq.gz.sam
参数:
-nint:如果reads比对次数超过多少次,就不在XA标签显示。
-rstr:定义头文件。‘@RG\tID:foo\tSM:bar’,如果在此步骤不进行头文件定义,在后续\oViewallpostsinGATK\t/2014/04/14/_blankGATK分析中还是需要重新增加头文件。
pairend:
bwasampe-a500read1.fq.gz.sairead2.fq.gz.sairead1.fq.gzread2.fq.gzread.sam
参数:
-aint:最大插入片段大小。
-oint:pairend两reads中其中之一所允许配对的最大次数,超过该次数,将被视为
singleend。降低这个参数,可以加快运算速度,对于少于30bp的read,建议降低-o值。
-rstr:定义头文件。同singleend。
-nint:每对reads输出到结果中的最多比对数。
对于最后得到的sam文件,将比对上的结果提取出来(awk即可处理),即可直接用于\oViewallpostsinGATK\t/2014/04/14/_blankGATK的分析。
注意:由于\oViewallpostsinGATK\t/2014/04/14/_blankGATK在下游的snp-calling时,是按染色体进行call-snp的。因此,在准备原始sam文件时,可以先按染色体将文件分开,这样会提高运行速度。但是当数据量不足时,可能会影响后续的VQSR分析,这是需要注意的。
2.对sam文件进行进行重新排序(reorder)
由BWA生成的sam文件时按字典式排序法进行的排序(lexicographically)进
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