原创力文档- 1、本文档共2页，可阅读全部内容。
- 2、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
无缝克隆同源重组克隆
Gibsonassembly
简介（INTRODUCTION）
原理：Gibsonassembly是一种onestep,onepot的迅速基因组装方法。它只要要将基因片段和需要
的三种酶混淆在同一个管内在50°C下培育15-60min就能够获得组装好的DNA。
装置原理鉴于DNA片段间的重叠地区，过程依靠于三种酶：DNA外切酶（T5exonuclease）,高保
真DNA聚合酶。（Phusionpolymerase）和耐热DNA连结（TaqDNAligase）的共同作用。首
先，T5核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’.每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，
因为着这两个相邻的突出片段有一部分拥有同源性能够互补，因此DNA片段退火，互补的序列从头配对连
结。而后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3方向将对应的脱氧核苷酸连结到单
链上，填充缺口。最后，连结酶将两条DNA单链黏合起来，密封裂痕。这样拥有重叠地区的DNA片段就
组装成一整条DNA分子了。下边是组装的表示图。
资料（MATERIALS）
试剂（REAGENTS）
NAD，H2O，1MMgCl2，1MDTT，10mMdNTPmix，1MTris-HClpH，50%PEG-8000，mg/
mLTagligase，μg/mLT5_ExO，Phusion(1×)、LB培育基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相
应抗性）
实验前准备（SETUP）
于冰水浴中配制以下反响系统。假如不慎将液体粘在管壁，可通太短暂离心使其沉入管底。
4xisothermalassemblybuffer
NAD20mg
H2O300μL
1MMgCl2300μL
1MDTT300μL
10mMdNTPmix600μL
1MTris-HClpH3mL
无缝克隆同源重组克隆
50%PEG-80003mL
加水到mL，每管分500μL存于-20°C或-80°C冰箱,够3000个反响
2×assemblymix:bestcombination:
100reaction1mL
mg/mLTagligase10μL
μg/mLT5_ExO100μL
Phusion(1×)25μL
4×.buffer500μL
加水365μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。
实验步骤（PROCEDURE）
设计引物经过PCR的方法在DNA片段的两头加上同源片段，NEB介绍同源片段的长度为15-40
bp，同时要求这部分对应的退火温度高于4°C。
1.进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收。或许PCR产物回收试剂盒回收。
2.进行重组反响，以20μL反响系统为例：
文档评论（0）