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1、革兰氏染色的原理、步骤及注意事项。（6）

答：原理：革兰氏染色是重要的鉴别染色法之一，其原理是G－细菌和G＋细菌细胞壁的成分和结构的不同。通过结晶紫液初染和碘液媒染后，在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的复合物（CVIdyecomplex）。G＋细菌（如金黄色葡萄球菌，Staphylococcusaureus，Sa）由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次多和交联致密，故遇脱色剂乙醇（或丙酮）处理时，因失水而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘的复合物牢牢留在壁内，使其保持紫色。反之，G－细菌（如大肠杆菌，Escherichiacoli，Ec）因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄和交联度差，遇脱色剂乙醇后，以类脂为主的外膜迅速溶解，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此细胞褪成无色。这时，再经沙黄等红色染料复染，就使G－细菌呈现红色，而G＋细菌则仍保留最初的紫色（实为紫加红色）了。――――（4分）

1min 1min

步骤：细菌涂片+结晶紫染液→冲洗+卢哥氏碘液 → 冲洗（吸干）+95%乙醇（脱

1min

未脱色（兰紫色）+沙黄（番红） → 兰紫色 →阳性（G+）

0.5min

色）→ 冲洗 1min

脱色（无色）+沙黄（番红） → 红色 →阴性（G-）

――――――――――――――――――（1分）

注意事项：（1）95%乙醇（脱色）时间0.5min是最关键步骤；

取菌量合适，涂片薄而均匀；

菌龄以18h为宜；

（4）染色时间：1min，1min，0.5min，1min。―――――――――（1分）

2、单细胞微生物微生物的典型生长曲线分为哪几个时期，各时期有何特点，对微生物发酵生产有何指导意义。（6）

答：单细胞微生物微生物的典型生长曲线分为四个时期：

延滞期：生长速率常数为零，细胞形态变大，rRNA含量增高，合成代谢活跃，对外界不良条件反应敏感。影响延滞期长短的因素：①接种龄：采用对数期“种子”，延滞期较短；而延滞期或衰亡期“种子”,延滞期较长；②接种量：接种量大，延滞期较短；接种量小，延滞期较长；③培养基成分：培养基成分丰富的，延滞期较短；培养基成分与种子培养基一致,延滞期较短。―――――――――――――――——————（1.5分）

指数期：生长速率常数R最大，细胞进行平衡生长，酶系活跃，代谢旺盛。影响指数期代时长短的因素主要有：①菌种：不同菌种的代时差异极大；②营养成分：营养越丰富，代时越短；③营养物浓度：影响微生物的生长速率和总生长量；④培养温度：影响微生物的生长速率。指数期微生物是增殖噬菌体的最适宿主菌龄，是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。————―（1.5分）

稳定期：生长速率常数R等于零，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，这时的菌体产量达到了最高点。稳定期到来的原因：①营养物质被消耗不能满足生长需要；②代谢废物或有害物质积累到抑制生长水平；③pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。稳定期是发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获期；某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段，故又称作代谢产物合成期；导致了连续培养原理的提出和工艺技术的改进。—————（1.5分）

衰亡期：生长速率常数R为负值，微生物个体的死亡速度超过新生的速度，整个群体呈现负生长状态。补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细菌培养物的存活时间。—――――――――――――（1.5分）

3、某养殖场鲟鱼发现细菌性肠炎，主要病原是某种细菌，试简述确定病原菌的方法及依据。

（6）

答：确定病原菌的依据为科赫法则：―————————————————————（1分）

病原微生物总是在患传染病的动物个体内发现而不存在于健康个体中；―（1分）

这一微生物可以离开动物体，并被培养为纯种培养物；————―（1分）

这种纯种培养物接种到敏感动物体后，应当出现特有的病症；————―（1分）

该培养物可以从患病的实验动物中重新分离出来，并可在实验室中再次培养，此后它仍然应该与原始病原微生物相同。————―（1分）

确定病原菌的方法为：分离病灶处的细菌并做纯培养，将纯培养各细菌接种到健康鲟鱼，选择接种后出现细菌性肠炎的鲟鱼，从病灶处再分离菌，该菌如经鉴定与原始接种菌一致，则此菌为鲟鱼细菌性肠炎的病原菌。————―（1分）

4、什么是干扰素，简述其作用机理。（4）

答：干扰素（interferons，IFNs）是高等动物细胞在病毒或dsRNA等诱生剂的刺激下，所产生的一种具有高活性、广谱抗病毒等功能的特异性糖蛋白，相对分子质量很小。它的功能除能抑制