SN∕T 4821-2017 牛脊椎畸形综合征TaqMan探针PCR检测方法.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T4821—2017

牛脊椎畸形综合征TaqMan探针PCR检测方法

DetectionmethodforbovinecomplexvertebralmalformationbyTaqManPCR

2017-07-21发布2018-03-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局

发布

I

SN/T4821—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任。

本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、国家质量监督检验检疫总局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：吴晓薇、刘中勇、贾广乐、彭小莉、陈茹、朱道中、鱼海琼、刘志玲、段燕瑜、林志雄。

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SN/T4821—2017

牛脊椎畸形综合征TaqMan探针PCR检测方法

1范围

本标准规定了牛脊椎畸形综合征(参见附录A)TaqMan探针PCR的检测方法。本标准适用于快速筛查牛群中隐性牛脊椎畸形综合征基因携带者。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件：

CVM脊椎畸形综合征(ComplexVertebralMalformation)TaqMan探针TaqMan探针(TaqManprobes)

PCR聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)

Ct值荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(Cyclethreshold)SNP单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism)

4原理

TaqMan法的SNP分型检测技术的原理：在普通聚合酶链反应的基础上时，加入一对两端有不同荧光标记的特异性探针来识别不同的等位基因(allelel和allele2)。5’端为报告荧光基团(reporter),3’端为淬灭荧光基团(quencher)。两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异性退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光；当特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，荧光报告基团被切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用(quench)从而发出荧光信号。根据检测到荧光信号的不同，可以判断相应样本的SNP等位基因型。

5仪器设备和试剂耗材

5.1仪器与设备

荧光定量PCR仪。恒温水浴锅。

台式冷冻离心机(转速可达到12000r/min)。

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漩涡混匀器。

冰箱(2℃~8℃、-20℃、-80℃)。

微量可调移液器(10μL、100μL、1000μL)及配套吸嘴。Ⅱ级生物安全柜。

5.2试剂与耗材

5.2.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。

5.2.2DEPC水：按照附录B制备，推荐使用商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水。

5.2.3饱和酚和异丙醇：分析纯，使用前预冷至-20℃。

5.2.4酚：三氯甲烷：异戊醇混合液：配制方法见附录B。

5.2.575%乙醇：配制方法见附录B

5.2.6荧光PCR试剂盒。

5.2.710%SDS:配制方法见附录B。

5.2.8阳性对照为采集阳性牛的血液样品，阴性对照为采集阴性牛的血液样品，均保存于-20℃备用。

6引物与探针序列

上游引物(CVM-F)5’-AGCTGGCTCACAATTTGTAGGT-3下游引物(CVM-R)5’-CTCAAA

扩增序列参见附录C

PROBE1:5’VIC:TCATGGCAGTICTCA-BHQ-3

PROBE2:5’FAM:TCATGGCATTTCTCABHQ-3’

采用DEPC水将每条引物和探针配制成100phol/L储存