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T/CAB
NADH氧化酶活力的测定分光光度法
1范围
本文件描述了测定NADH氧化酶活力的分光光度法。
本文件适用于生化试剂、工业酶制剂中NADH氧化酶活力的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期
的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括
所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
NADH氧化酶活力单位NADHoxidaseactivityunit
在30℃、pH7.0的条件下，每分钟氧化1μmolNADH所需的酶量为一个酶活力单位，单
位为U。
4原理
++
NADH氧化酶催化底物NADH的氧化生成NAD，NAD在340nm下无吸收，而NADH
有吸收，其ε=6.22mM-1cm-1，通过监测340nm下吸光度的变化来测定NADH的消耗，
340
计算酶活力。
5试剂
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。
5.1还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）：CAS号606-68-8，纯度≥98%。
5.2黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）：CAS号84366-81-4，纯度≥95%。
5.3三羟基甲基氨基甲烷（Tris）-HCl缓冲液：50mmol/L，pH7.0。
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T/CAB
5.4反应底物溶液：含0.13mmol/LNADH、0.1mmol/LFAD及50mmol/LTris，pH7.0。
使用分析天平准确称取9.2mgNADH和8.3mgFAD溶解在100mL的Tris-HCl缓冲液（5.4）
中，充分混匀，现用现配。
6仪器设备
6.1分析天平：感量为0.001mg。
6.2pH计：精度为0.01。
6.3紫外-可见分光光度计：带有温控比色皿槽，波长精度为1nm，吸光度值精度为0.001。
6.4石英比色皿：1cm。
6.5移液器：10μL、1000μL。
7试样制备和试验步骤
7.1试样酶液的制备
7.1.1液体样品待测酶液制备
使用移液器移取适量NADH氧化酶液体样品溶于水中进行稀释，使待测酶液活力控制在
15U/mL以下。
7.1.2固体样品待测酶液制备
使用分析天平称取适量NADH氧化酶固体样品（精确至0.0001g）溶于水中，使待测酶
液活力控制在15U/mL以下。
7.2测定
使用移液器准确移取1000μL反应底物溶液于石英比色皿中，置于分光光度计的温控比
色皿槽内，待温度稳定于30℃±1℃后，迅速用移液器加入10μL待测酶液，加盖颠倒混匀
后立即放入分光光度计，在340nm下扫描1min，保存吸光度曲线。通过线性回归方程计算
斜率。每个待测酶液平行测定三次。
8试验数据处理
8.1液体样品
试样中NADH氧化酶活力按式（1）计算：
()
+××
=12····················································(1)
1
×2
式中：
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