NYT 2841-2015 猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法.docx

ICS11.220B41

中华人民共和国农业行业标准

NY/T2841—2015

猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法

MethodofdetectingtransmissiblegastroenteritisvirusbyRT-nPCR

2015-10-09发布2015-12-01实施

中华人民共和国农业部

发布

I

NY/T2841—2015

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由全国动物卫生标准化技术委员会归口(SAC/TC181)。

本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、东北农业大学、河南农业大学、河南牧业经济

学院。

本标准起草人：邵卫星、魏荣、李晓成、李一经、黄耀华、魏战勇、徐耀辉、吴发兴、张志、刘爽、董亚琴、孙映雪、李卫华、王树双、黄保续。

NY/T2841—2015

猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法

1范围

本标准规定了检测猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR方法的技术要求。

本标准适用于检测疑似感染猪传染性胃肠炎病毒的猪的新鲜粪便、小肠组织及肠内容物和细胞培养物中的猪传染性胃肠炎病毒的核酸，可作为猪传染性胃肠炎的辅助诊断方法和细胞培养物中猪传染性胃肠炎病毒的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

3缩略语

下列缩略语适用于本文件：

AMV:禽成髓细胞瘤病毒avianmyeloblastosisvirus

RT-nPCR:反转录一巢式聚合酶链式反应reversetranscriptase-nestedpolymerasechainreac-tion

RNA:核糖核酸ribonucleicacid

DEPC:焦碳酸二乙酯diethypyrocarbonate

PBS:磷酸盐缓冲液(配方见附录A.1)phosphate-bufferedsalinebuffer

Taq酶：TaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase

dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸deoxyribonucleosidetriphosphatesbp:碱基对basepair

4试剂

除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的灭菌双蒸水或超纯水。提取RNA所用试剂均须使用无RNA酶水配制，分装的容器需无RNA酶。

4.1磷酸盐缓冲液：配方见附录A.1。

4.2RNA提取试剂：TrizolLS。

4.3氯仿(警告：危险)。4.4异丙醇。

4.575%的乙醇。

4.6DNA分子量标准：DL2000。

4.7AMV反转录酶及反应缓冲液。

4.8dNTPsMixture。

4.9RNA酶抑制剂(40U/μL)。

4.10rTaqmix。

4.11反转录及PCR扩增引物：见附录B。

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NY/T2841—2015

4.12无RNA酶超纯水。

4.131.5%琼脂糖：配方见A.3。

4.14电泳缓冲液(TAE):配方见A.4。

4.15样品处理液：配方见A.2。

4.16阳性样品：参见C.1。

4.17阴性样品：参见C.2。

5仪器设备

5.1高速冷冻离心机：要求最大离心力在12000×g以上。

5.2PCR扩增仪。

5.3核酸电泳仪和水平电泳槽。

5.4恒温水浴锅。

5.52℃~8℃冰箱和—18℃冰箱。

5.6微量加样器(0.5μL～10μL,2μL～20μL,20μL～200μL,100μL～1000μL)。

5.7组织研磨器或研钵。

5.8凝胶成像系统(或紫外透射仪)。

6样品的采集、运输和处理

6.1样品采集和运输

宜采集腹泻急性期的小肠或新鲜粪便。采集小肠(5cm～10cm)或新鲜粪便(5g～10g),置于样品密封袋中，在低温保存箱中送实验室，应确保样品到实验室时附带的冰袋未完全融化；如不能及时检测，应将样品置于低于一18℃冰箱中保存。

6.2样品处理

6.2.1小肠样品

取1cm～3cm小肠组织，用剪刀剪碎，加入