蚯蚓纤维蛋白溶解酶的提取分离纯化专家讲座.pptx

蚯蚓纤维蛋白溶解酶提取分离纯化;酶是植物体内含有催化作用蛋白质，动植物体内生化反应，普通都是在酶作用下进行，没有酶催化反应，动植物生命也就停顿了，所以对酶研究是说明生命现象本质中十分主要部分。为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不一样研究目标对酶制剂纯度要求也不相同，有些工作只需要粗酶制剂即可，而有些工作则要求较纯酶制剂，需依据不一样情况区分对待。在酶提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶活性，经过酶活性测定以监测酶去向。

;酶存在位置？;什么是酶提取与分离纯化？;酶粗提液是否只有酶，有没有其它物质？;怎样将酶从粗提液中分离纯化？;沉淀蛋白质经离心后搜集之，再溶于少许缓冲溶液中，经透析或凝胶柱过滤，以除去硫酸铵及其它小分子杂质，然后再经过柱层析分离。因为吸附剂不一样，又有吸附柱层析、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等。对于不一样支持物采取洗脱方法也不一样，分子筛类型凝胶过滤柱层析，洗脱液只要用一定浓度缓冲液就能够了，亦即等浓度洗脱。对于吸附柱和离子交换柱层析，往往要采取浓度梯度溶液进行洗脱，最方便是线性梯度浓度，当然用非线性梯度会得到更加好分离效果。柱层析普通都需要自动搜集仪，假如能配用蛋白质检测仪就更加好了。当前柱层析和硫酸铵分级沉淀一样，已经成为一个常规酶分离提纯步骤之一了;近年来纯化酶惯用一个有效方法为亲和层析。主要利用酶和底物、抑制剂或辅酶含有一定结合能力，这一性质即可用来分离、提纯酶。首先选择一支持物，如琼脂（Sepharose）将底物、竞争性抑制剂或辅酶，以共价键形式连接到支持物上，然后把含有酶溶液，流过装有专一性底物、竞争抑制剂或辅酶层析柱，酶即被保留在支持物上，再经过充分洗涤除去未被吸附杂质，然后用含有一定浓度底物或竞争性抑制剂或辅酶缓冲液，进行竞争性洗脱。假如亲和剂选择适当，往往能得到较高纯度酶，是酶分离、纯化中既方便又最有效一个方法。;蚯蚓,俗称地龙,在我国入药已经有几千年历史。地龙为步骤动物门钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉???毛蚓或栉肓毛蚓干燥体。前一个习称“广地龙”,后三种习称“泸地龙”,主产于广西、广东、福建。性寒,味咸。清热定惊,通络、平喘,利尿;用于高热神昏惊痫抽搐,关节麻痹,肢体麻木,半身不遂,肺热喘咳,尿少水肿,高血压症。地龙是我国主要中药材之一。最早中药学专著《神农本草经》中收载67种动物药中就有蚯蚓。李时珍著《本草纲目》虫部42卷中用蚯蚓入药处方有40各种。

;蚯蚓中含有蚯蚓素,酶,维生素等各种营养成份,具降压平喘,解热,利尿通络,抗过敏,解毒生肌,溶栓纤维及抗凝血等药理作用。自1983年日本宫崎医科大学美源恒极道、从蚯蚓中提取了含有较高活性纤溶酶以来,国内外纷纷研究此酶,大量试验证实,该药在动物试验中口服及注射都有抗栓溶栓作用。;蚯蚓结构图;蚯蚓纤维蛋白溶解酶提取;纤溶酶活检测方法;蛋白质纯度检测;蛋白质浓度检测;1、将粗酶液过2万d及5万d超滤膜。

2、超滤后各段酶液以上述纤维酶活检测方法中测活力得纤溶酶主活力部分在2一5万d之间

3、将超滤后2一5万d间酶液经浓缩5倍后上G一100柱,以PH6.5磷酸缓冲液洗脱,以FC一95搜集63（4.2ml/管,8秒/滴),以752紫外光栅分光光度计测280nm处吸收情况。

4、测洗脱液酶活,得其活力部分在第2峰酶活曲线。

;5、将G一100柱洗脱液活力峰合并,加人DEAE-C52柱深入纯化,先以PBS洗涤至下柱液A2800.03后以0.5一1.4%NaCl-PBS液梯度洗脱,搜集120管。4秒/滴、3.2ml/管、以752紫外光栅分光光度计测光吸收。

6.测酶活，找出主峰活力峰，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测此峰得到条带得以分离此蛋白酶。;洗脱电泳将切下凝胶条分别置于分子截留量为3kD透析袋中,袋内含5%乙酸。透析袋置水平电泳槽内,电极缓冲液为5%乙酸,150V恒压电泳90min。搜集袋内液体,以蒸溜水透析24h,冻干后各溶于0.01%乙酸中。;谢谢！