GBT 33526-2017 转基因植物产品数字PCR检测方法.docxVIP

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中华人民共和国国家标准

GB/T33526—2017

转基因植物产品数字PCR检测方法

GeneticallymodifiedorganismdetectionmethodbydigitalPCR

2017-02-28发布2017-09-01实施

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会

发布

I

GB/T33526—2017

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。

本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院、广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国农业大学、中国农业科学院油菜作物研究所。

本标准主要起草人：付伟、杜智欣、王勤、王慧煜、许文涛、吴刚、朱水芳、刘晓飞。

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GB/T33526—2017

转基因植物产品数字PCR检测方法

1范围

本标准规定了转基因成分检测的数字PCR方法。

本标准适用于玉米、大豆、油菜、水稻、马铃薯、苜蓿、棉花等转基因植物及其产品的转基因成分数字PCR检测。

本标准所能达到的检测低限为0.1%(质量分数)。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义

GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

18srRNA基因18srRNAgene

转录自18srDNA,是细胞核糖体的组分之一。

3.2

CaMV35s启动子基因CaMV35spromotor

来自花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus,CaMV)的35s启动子。

3.3

NOS终止子基因NOSterminitor

来自胭脂碱合成酶基因NOS的终止子。

4原理

数字PCR其技术原理是通过将原始PCR反应体系进行分割，进而对所有小的反应体系进行扩增并后续检测。通过对反应体系进行有限的分割，从而使整个反应体系可以更加耐受核酸抑制因子，并且更加稳定、准确、快速地对痕量的转基因成分进行精准鉴定。

现阶段数字PCR的实现形式包括芯片式数字PCR与微滴式数字PCR两种。其中芯片式数字PCR通过微流控芯片实现对原始反应体系的分割，这种分割方式具有稳定性好、均一性好的优点，但是这种分割方式的实验成本相对较高；微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分

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GB/T33526—2017

割。这种分割方式具有反应速度快，分割成本低的优点，但是相对来说，这种分割方法的稳定性较差，而且对于数据分析的要求也相对较高。由于数字PCR的平台差异，对不同数字PCR平台进行的数据协同分析也成为了目前数字PCR检测方法发展的关键。

本标准针对通用筛选元件CaMV35s启动子和NOS终止子设计选取特异性引物和探针进行数字PCR扩增，并根据扩增结果来判定CaMV35s启动子和NOS终止子的外源筛选元件成分。另外，通过芯片式数字PCR和微滴式数字PCR的协同比对，本标准方法可以在两种平台中达到同样的检测目的。

5试剂与材料

除非有特殊说明，仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。

5.1DNA提取试剂盒

推荐针对不同的样品基质类型选取不同的基因组提取试剂盒。

5.2数字PCR反应试剂盒

推荐按照不同的数字PCR平台的说明书选取其推荐的数字PCR反应试剂盒。

5.318srRNA基因引物和探针

18s-F:5-CCTGAGAAACGGCTACCAT-318s-R:5-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3′

18s-P:5-VIC-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1-3′

5.4CaMV35s启动子基因引物和探针

p35s-F:5-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3′p35s-R:5-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3

p35s-P:5-VIC-CCCACTATCCTTCGCAA