NY∕T 2744-2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检测 核酸斑点杂交法.docxVIP

ICS65.020B16

中华人民共和国农业行业标准

NY/T2744—2015

马铃薯纺锤块茎类病毒检测核酸斑点杂交法

Detectionofpotatospindletuberviroid(PSTVd)—

Nucleicacidspothybridization(NASH)

2015-05-21发布2015-08-01实施

中华人民共和国农业部

发布

NY/T2744—2015

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由农业部种植业管理司提出并归口。

本标准起草单位：农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心(哈尔滨)、中国农业科学院植物保护研究所、黑龙江八一农垦大学。

本标准主要起草人：邱彩玲、刘尚武、张志想、吕典秋、白艳菊、李世访、王绍鹏、魏琪、董学志、耿宏伟、万书明、金光辉、高艳玲、郭梅、闵凡祥、王亚洲、杨光辉、王晓丹、申宇、张威、范国权、张抒、宿飞飞、李勇、胡林双、马纪、刘振宇、高云飞、杨帅、李学湛。

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NY/T2744—2015

马铃薯纺锤块茎类病毒检测核酸斑点杂交法

1范围

本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒(PotatoSpindleTuberViroid,PSTVd)的检测方法。本标准适用于马铃薯的马铃薯纺锤块茎类病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB7331马铃薯种薯产地检疫规程GB18133马铃薯种薯

NY/T1962—2010马铃薯纺锤块茎类病毒检测

3原理

经过标记的PSTVd探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针，鉴定马铃薯组织是否感染PSTVd。

4试剂与材料

以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水。

4.1CHCl?(三氯甲烷)。

4.2正电荷尼龙膜(Hybond-N+)。

4.3抗地高辛-AP(Anti-Digoxigenin-AP)。

4.4CDP-Star(化学发光法使用)。

4.5X光片(化学发光法使用)。

4.6显影液、定影液(化学发光法使用)。

4.7Tween-20(Cs?H?O?g,聚氧乙烯去山梨醇单月桂酸酯)。

4.8杂交液。市售。

4.910×阻断液。市售。

4.10提取缓冲液。在160.0mL蒸馏水中依次加入NaCl11.7g、MgCl?0.4g、醋酸钠(CH?COONa)8.21g、无水乙醇40.0mL和十二烷基磺酸钠(SodiumDodecylSulfate,SDS)6.0g,用HCl或NaOH

调节pH至6.0。

4.1120倍柠檬酸缓冲液储备液(20×SSC储备液)。在800mL水中加入NaCl175.3g、柠檬酸钠

88.2g,加入数滴10mol/LNaOH溶液调节pH至7.0,加水定容至1L,分装后高压灭菌。或者选择市售商品。

4.1210%SDS。在80mL水中加入SDS10g,溶解后定容至100mL。

4.132×SSC/0.1%SDS。在35.6mL蒸馏水中加入20倍柠檬酸缓冲液储备液(4.11)4mL,10%SDS(4.12)400pL,混匀。

4.140.1×SSC/0.1%SDS。在39.4mL蒸馏水中加入20倍柠檬酸缓冲液储备液(4.11)200μL,

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10%SDS(4.12)400μL,混匀。

4.15马来酸缓冲液。在800mL水中加入马来酸(顺丁烯二酸，C?H?O?)11.607g,NaCl8.77g,用NaOH调pH至7.5(20℃),定容至1L,5℃~25℃稳定。

4.16洗涤缓冲液。在100mL马来酸缓冲液(4.15)中加入0.3mLTween-20(4.7),混匀，5℃~25℃稳定。

4.175×检测缓冲液。在80mL水中加入Tris-HCl7.88g,NaCl2.92g,用HCl或