膜片钳技术及应用.ppt

膜片钳技术四种基本记录模式细胞吸附膜片(cell-attached?patch)将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管电极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流，称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整性，第23页,共31页，星期六，2024年，5月全细胞记录法(Whole-cell?recording)?????在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。第24页,共31页，星期六，2024年，5月内面向外膜片(inside-out?patch)高阻封接形成后，在将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中就得到“内面向外”膜片。第25页,共31页，星期六，2024年，5月外面向外膜片（Outside-outpatch）在全胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成。第26页,共31页，星期六，2024年，5月膜片钳技术的应用2008年，第二军医大学基础部生物物理研究所的研究人员采用膜片钳和激光扫描共聚焦显微镜，同步实时系统观察心肌细胞钙离子的释放。第27页,共31页，星期六，2024年，5月基本原理膜片钳能获得膜上钙离子通道的离子电流，但不能对离子的移动进行实时定位，不能定量分析离子浓度。激光扫描共聚焦显微镜可以对钙离子的移动进行实时定位,但无法对单个离子通道的离子移动信号(如单通道电流)进行分析。第28页,共31页，星期六，2024年，5月大鼠心室肌细胞L2型钙通道电流(ICa,L)第29页,共31页，星期六，2024年，5月采用膜片钳-激光扫描共聚焦显微镜同步实时控制系统可同时记录心肌细胞L2型钙离子电流信号及胞浆内Ca2+浓度变化，这样才能解决显微形态与功能分析同步实时分析的问题，有助于进一步了解膜上钙离子通道的内部机制。第30页,共31页，星期六，2024年，5月*感谢大家观看第31页,共31页，星期六，2024年，5月关于膜片钳技术及应用膜片钳技术向细胞内注射恒定或变化的电流刺激，纪录由此引起的膜电位的变化，这叫做电流钳技术。在具体实验中，可通过给予细胞一系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。第2页,共31页，星期六，2024年，5月电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反。因此它可以反映离子流的大小和方向。第3页,共31页，星期六，2024年，5月膜片钳技术膜片钳技术与电流钳、电压钳技术在命名上并不完全一致，后两者是从电学概念的角度命名的，而“膜片钳”主要是从机械物理学的角度命名的。第4页,共31页，星期六，2024年，5月膜片钳技术从字面上理解，膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其他细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。第5页,共31页，星期六，2024年，5月膜片钳技术所以，膜片钳技术是一种通过微电极与细胞膜之间形成紧密接触的方法，采用电压钳或电流钳技术对生物膜上的离子通道的电活动进行记录的微电极技术。膜片钳技术是一种特殊的电压钳/电流钳技术。第6页,共31页，星期六，2024年，5月膜片钳技术用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，使之形成10～100GΩ的密封，被孤立的小膜片面积为μm2量级，内中仅有少数离子通道。然后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离子通道开放产生的pA量级的电流，这种通道开放是一种随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布，并分析膜电位与离子浓度等之间的关系。第7页,共31页，星期六，2024年，5月膜片钳实验系统虽然可因研究目的不同而有所区别，但其基本组成是相同的，包括膜片钳放大器和接口，显微镜和视频监视器以及防震台和屏蔽罩等。第8页,共31页，星期六，2024年，5月倒置显微镜、防震台、屏蔽罩、三维操纵仪三维操纵仪倒置显微镜第9页,共31页，星期六，2024年，5月膜片钳放大器第10页,共31页，星期六，2024年，5月膜片钳实验流程膜片钳实验方