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染菌的检查、原因分析和防止措施
染菌的检查、原因分析和防止措施
1.染菌的检查与判断
在发酵过程中对杂菌污染的及早发现,及时处理,是免除染菌造成严重损失的重要问题。因
此,要求有确切、迅速的方法来检出杂菌的污染,目前常用方法主要有以下几种:
(1)显微镜检查
通常用革兰氏染色法,染色后在高倍显微镜下观察。对霉菌、酵母发酵,先用低倍显微镜
观察生产菌的特征,然后再用高倍显微镜观察有否染菌存在,根据生产菌与杂菌的特征区别,
判断是否染菌。必要时,可进行芽孢和鞭毛染色。
(2)平板划线培养或斜面培养检查法
先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱摄氏37度,保温24h检查无菌即可
使用。将需要检查的样品,在无菌平板上划线,分别置摄氏37度、摄氏27度培养,以适
应嗜中菌和低温菌的生长,一般在8h后即可观察。
噬菌体检查可采用双层平板培养法,底层同为肉汁琼脂培养基,上层减少琼脂用量。先将
灭菌的底层培养基熔后倒平板,凝固后,将上层培养基熔解并保持摄氏40度,加生产菌作
为指示菌和待检样品混合后迅速倒在底层平板上,置培养箱保温培养,经12~20h培养,观
察有无噬菌斑。
培养基(PH7.0)
葡萄糖(%)牛肉膏(%)蛋白胨(%)氯化钠(%)琼脂(%)
上层0.51.01.00.51.0
下层0.51.01.00.52.0
(3)肉汤培养检查法
将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中,放置摄氏37度和摄氏27
度分别培养24h,进行观察,并取样镜检。此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌,也
可用于噬菌体检查,此时使用生产菌作为指示菌。
葡萄糖酚红肉汤培养基:牛肉膏0.3%,葡萄糖0.5%,氯化钠0.5%,蛋白胨0.8%,1%
酚红溶液0.4%,PH7.2。
用以上的检查方法检查未发现污染,还不能肯定未被污染。
除以上方法外,还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌,如溶解氧、PH值、排气
中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。
2.发酵染菌率和染菌原因分析
(1)发酵染菌率
发酵的总染菌率是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。
发酵染菌是在发酵罐中发生的染菌率,包括染菌后被挽救不了导致倒罐的批数,但种子罐
培养的染菌不接入发酵罐,不导致发酵染菌的另行计算。
(2)染菌原因分析
在发酵染菌之后,必须分析染菌原因,总结发酵染菌的经验教训,把发酵染菌消灭在发生
之前,防患于未然,是积极制服发酵染菌的最重要措施。
造成发酵染菌的原因很多,但总结归纳起来,其主要原因有:无菌空气带菌、设备渗漏、
灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善。在发生染菌后,根据无菌试验结果,参考以下方法
进行分析,找出原因,杜绝污染。
(A)
从染菌时间来看,发酵早期染菌,可能原因有:种子带菌,培养基和设备灭菌不彻底,接
种操作不当,无菌空气带菌;发酵后期染菌,可能原因有:中间补料污染,设备渗漏,操作
问题。
(B)
从污染的杂菌种类来看,污染耐热的芽孢杆菌,可能是培养基或设备灭菌不彻底;污染球
菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌可能是种子带菌,设备渗漏;污染霉菌,一般是无菌室灭菌不
彻底或操作问题。
(C)
从染菌的幅度来看,如果各个发酵罐或多个发酵罐染菌,而且所污染的是同一种杂菌,一般
是空气系统问题;如果各别罐连续染菌,一般是设备问题。
以上仅仅是在分析问题时作为考虑问题的入门,应根据具体情况综合分析,且通过进一步
的无菌检查来验证。
3.杂菌污染途径及预防
(1)种子带菌及防止
种子带菌的原因主要有以下几方面
(A)培养基及用具灭菌不彻底
菌种培养基及用具灭菌均在灭菌锅中进行,造成灭菌不彻底主要是灭菌时锅内空气排放不
完全,造成假压,使灭菌时温度还达不到要求。
(B)菌种在移种过程中受污染
菌种的移接工作是在无菌室中,按无菌操作进行。当菌种移接操作不当,或无菌室管理不
严,就可能引起污染。因此,要严格无菌室管理制度和严格按无菌操作接种,合理设计无菌
室。
(C)菌种在培养过程或保藏过程中受污染
菌种在培养过程和保藏过程中,由于外界空气
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